La riproduzione vegetativa, definita come un processo indispensabile al mantenimento in vita della specie a opera di preesistenti individui, rappresenta una modalità fondamentale nel mondo vegetale. Sebbene la riproduzione gamica e i cicli metagenetici abbiano segnato l'evoluzione delle piante, la capacità di propagazione asessuale rimane un pilastro della biologia vegetale. In questo contesto, l’embriogenesi somatica si distingue come una tecnica biotecnologica avanzata che permette la differenziazione di embrioni a partire da cellule somatiche indifferenziate, bypassando il complesso processo di fecondazione.
Fondamenti biologici dell'embriogenesi somatica
L'embriogenesi somatica è la produzione di embrioni somatici da cellule indifferenziate; da ciascuna delle cellule selezionate in un opportuno terreno di coltura si possono ottenere embrioni somatici, così denominati perché prendono origine dal soma o corpo diploide per successive divisioni mitotiche guidate dalla composizione del terreno di coltura. In natura, l'embrione è allocato in un organo, detto seme, il quale si origina nella pianta adulta attraverso una riproduzione sessuata. In vitro si accrescono embrioni somatici non circondati da endosperma e da tegumenti, ma singoli embrioni isolati, che potremmo definire semi artificiali.
Il processo di embriogenesi somatica consiste nella differenziazione di embrioni da tessuti di diversa origine, quali foglie, parti del fiore immaturo, internodi, ecc. In vite questo avviene in modo indiretto, mediante la formazione di callo (callogenesi) e la successiva differenziazione degli embrioni (embriogenesi). Da tali embrioni si sviluppa una pianta intera con un processo molto simile a quello proprio dell'embrione zigotico. La carota è considerata uno studio modello per l’embriogenesi somatica: partendo da un espianto, dalle porzioni di ipocotili si formerà del callo. Per produrre embrioni somatici, è necessario stabilire una coltura di calli in vitro partendo da un espianto, inducendo la formazione di calli utilizzando un rapporto specifico di citochina e auxina. I fitormoni, come auxina e citochinina, sono essenziali per l'organogenesi.
Piattaforme tecnologiche per la coltura in vitro
Le moderne infrastrutture, come la piattaforma CRI - Fondazione E., offrono servizi di coltura in vitro ed applicazioni biotecnologiche all'avanguardia principalmente per gli alberi da frutto, in particolare vite e melo. Tali servizi possono essere di supporto sia alla ricerca biologica di base sia al breeding tradizionale. La dotazione tecnologica include cappe sterili a flusso laminare orizzontale e verticale, cappe ISO classe 3 a pressione positiva con filtri HEPA/ULPA aventi un'efficienza di filtrazione di particelle inquinanti fino al 99.99%.
Le camere di crescita dispongono di moduli a più livelli con controllo di luce, temperatura e umidità relativa (RHT), permettendo di impostare un ampio range di valori. La serra riscaldata, con 4 celle climatiche e circa 70 m2 di spazio bancali, consente il controllo da remoto di temperatura (riscaldamento aereo + pavimento) e fotoperiodo, con irrigazione a flusso e riflusso e reti antipolline. Queste condizioni sono fondamentali per la produzione di callo embriogenico di vite, che a partire da antere ed ovari di vite, può produrre colture di embrioni somatici stabili ed omogenee, ideali per il trasferimento genico.
Applicazioni nel risanamento virale e genomica funzionale
Le biotecnologie si servono di una caratteristica particolare dei tessuti vegetali per combattere le virosi: esistono infatti cellule vegetali che per le loro caratteristiche fisiologiche non possono essere attaccate dai virus. Tali cellule sono quelle meristematiche presenti negli apici del fusto e della radice; queste cellule sono sempre sane ed in grado di mantenere il patrimonio genetico e le potenzialità produttive della pianta officinale. Le biotecnologie prelevano l'espianto contenente queste cellule "immuni", che verranno isolate e seminate in un terreno di coltura solido; si ottiene così un callo sano della specie officinale malata.
Non esistendo ad oggi la possibilità di effettuare direttamente trattamenti in campo per mancanza di fitofarmaci antivirali validi, il principale metodo di lotta preventiva è la diffusione di materiale di propagazione sano. La tecnica dell'embriogenesi somatica è risultata estremamente efficace: il risanamento da virus quali Grapevine leafroll-associated virus-1 e -3 (Glrav-1 e Glrav-3), Grapevine virus A (Gva) e Grapevine fleck virus è stato del 100% in tutte le prove eseguite. Inoltre, questa tecnica ha permesso di ottenere pieno successo nel risanamento da Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (Grspav), virus per il quale le tecniche tradizionali avevano portato a percentuali di risanamento non superiori al 29%.
Per la caratterizzazione funzionale di geni candidati, la piattaforma permette l'ottenimento di mutanti funzionali con inattivazione/sovra-espressione del gene di interesse in genotipi di vite e melo altamente trasformabili. La principale tecnologia usata per modificare i geni è il gene editing tramite il sistema CRISPR/Cas9 con RNA guida singolo o multiplo. L'identificazione di geni chiave nella risposta della pianta agli stress biotici/abiotici può essere sfruttata per produrre nuovi genotipi attraverso il breeding tradizionale o applicando le tecnologie di editing genetico più all'avanguardia, come la cisgenesi.
Crispr-cas 9 le forbici del DNA
Considerazioni sulla dinamica dei tessuti e processi di crescita
L'embriogenesi somatica è un sistema modello importante perché permette di comprendere i meccanismi di regolazione genica necessari per i primi eventi di sviluppo nel ciclo vitale di una pianta superiore. È necessario stabilire una coltura di calli in vitro partendo da un espianto e, in alcuni casi, trasferire il materiale in un terreno privo di fitormoni per proseguire lo sviluppo.
In studi correlati alla scienza dei materiali applicata, si è osservato che il volume cristallino nello strato di seme può essere controllato mediante ricottura termica. Secondo l'effetto di cristallizzazione indotta da metalli, la presenza del metallo induce una cristallizzazione a temperatura più bassa del silicio negli strati di seme. I dati di diffrazione a raggi X e microscopia elettronica a scansione mostrano che la formazione di siliciuri di palladio nello strato di seme guida la crescita di colonne simili a fili, la cui morfologia varia in base alla microstruttura dello strato di seme e ai parametri di ablazione laser. È stato suggerito che il palladio superficiale influenzi anche il tasso di crescita migliorando la dissociazione del Si2H6.
Evoluzione delle strutture riproduttive nelle Spermatofite
Le trasformazioni sono differenti nelle Gimnosperme rispetto alle Angiosperme e riflettono differenti stadi dell'evoluzione che ha portato dai macrosporangi delle Pteridofite al fiore delle Spermatofite. Nelle Angiosperme, la maggiore novità è data dal fatto che l'ovulo non è più nudo come nelle Gimnosperme, ma contenuto in una cavità, l'ovario, che deriva dalla saldatura di una o più foglie carpellari.
Nella nocella si differenzia uno strato esterno sterile ed un tessuto pluricellulare interno fertile da cui si differenziano le cellule madri delle megaspore. In un gametofito normale monomegasporiale, la megaspora superstite dopo la meiosi subisce un'ampia vacuolizzazione interna, quindi il suo nucleo si divide per cariocinesi e i due nuclei figli si dispongono ai due poli della cellula. Successivamente, a ciascun polo, i nuclei subiscono due divisioni originando due gruppi di quattro nuclei. Dall'apparato dell'oosfera una delle tre cellule si trasforma in oosfera o cellula uovo. Il nucleo spermatico si fonde con l'oosfera mentre un altro nucleo si fonde con il nucleo dell'endosperma secondario originando un nucleo triploide. Per divisioni successive tale nucleo forma un tessuto pluricellulare detto endosperma secondario, con funzioni di riserva nutritiva, mentre lo zigote derivante dalla fecondazione si divide attivamente formando l'embrione.
Prospettive per la conservazione e la moltiplicazione
La propagazione in vitro offre diversi vantaggi per la conservazione a lungo termine di cloni o accessioni di interesse, tra cui il mantenimento nel tempo del fenotipo desiderato, uso di spazi esigui e limitata attività di mantenimento. Indubbiamente la rigenerazione per embriogenesi somatica ha grossi vincoli, come i tempi lunghi, la forte dipendenza dal genotipo e la trueness-to-type delle piante rigenerate da accertare, che ancora non le permettono di affiancarsi alle tecniche tradizionali di risanamento nelle applicazioni di routine.
In compenso, presenta un grande interesse dal punto di vista scientifico, mostrando di essere potenzialmente il metodo più efficace per ottenere una vite totalmente virus-esente. Si consideri che la vite è la coltura agraria in cui è stato identificato il più alto numero di agenti patogeni virali. L'applicazione di queste tecnologie permette non solo di preservare la biodiversità, ma anche di migliorare la produttività degli impianti, garantendo una stabilità genetica che spesso viene compromessa dalla variabilità naturale o dalle infezioni patogene.
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