Nei trattamenti di fecondazione in vitro (FIV), sia che si tratti di FIV convenzionale che di ICSI, gli embrioni vengono coltivati in laboratorio per alcuni giorni, in modo da poter decidere quale(i) sarà(saranno) trasferito(i) nell'utero e quale(i) sarà(saranno) congelato(i) (vetrificato(i)). Per prendere la decisione, la sua qualità deve essere valutata durante tutte le fasi dello sviluppo embrionale. A seconda del giorno di sviluppo dell'embrione, gli embriologi analizzano diverse caratteristiche per determinare quale sia la sua qualità e se sono suscettibili di essere impiantate per dare origine ad una gravidanza.
Come e perché si misura la qualità embrionale?
Nei processi di FIV-ICSI, in cui la fecondazione degli ovociti viene effettuata in laboratorio, è importante valutare la qualità degli embrioni risultanti. È comune che si ottenga più di un embrione, quindi la sua classificazione aiuta a scegliere quali embrioni tra tutti quelli in coltura hanno più probabilità di impiantarsi e di dare origine ad una gravidanza. Pertanto, per il trasferimento si terrà conto della classificazione degli embrioni, poiché gli embrioni di qualità più elevata saranno quelli introdotti nell'utero della madre.
La valutazione della qualità degli embrioni richiede che si tenga conto delle diverse caratteristiche della loro morfologia, cioè della loro forma o aspetto, e dell'evoluzione nei giorni in cui rimangono in coltura. Per fare questo ci sono due opzioni: rimuovere gli embrioni dall'incubatrice ogni giorno per alcuni minuti in modo che possano essere valutati al microscopio, oppure valutare gli embrioni utilizzando un sistema time-lapse, che permette di ottenere immagini ogni pochi minuti per valutare il loro completo sviluppo senza rimuoverli dall'incubatrice.
L'uso di sistemi time-lapse permette all'embriologo di osservare l'intero sviluppo embrionale, non solo i momenti specifici in cui l'osservazione verrebbe effettuata al microscopio. Inoltre evita le variazioni di temperatura e i gas che si producono quando gli embrioni vengono prelevati dall'incubatrice, riducendo lo stress e migliorando la vitalità degli embrioni.
Primi giorni di sviluppo embrionale
Sia con la visualizzazione diretta al microscopio che con il sistema time-lapse, gli embrioni vengono valutati quasi ogni giorno fino al trasferimento o al congelamento. A seconda del giorno, gli embriologi dovranno prestare attenzione ad alcuni o altri aspetti della morfologia embrionale per poterli classificare. Il giorno dopo la fecondazione (giorno 0) deve essere confermato se gli ovuli hanno fecondato con la comparsa del primo stadio embrionale: lo zigote.
Si tratta di una singola cellula che non ha ancora iniziato a dividersi e nella quale si deve osservare la presenza di due pronuclei (NP), uno dall'ovulo e uno dallo sperma; la presenza di due globuli polari (PC), che indicano che dopo la fecondazione la meiosi dell'uovo è stata completata; e l'aspetto del citoplasma dello zigote, che deve essere uniforme e chiaro. Per evitare interpretazioni errate, è importante effettuare questa valutazione tra 16 e 18 ore dopo l'inseminazione in vitro o la microiniezione. Se gli zigoti vengono osservati più tardi, i pronuclei potrebbero essere scomparsi.
Embrione il giorno 2 e 3: dallo sviluppo cellulare alla crescita
Due giorni dopo l'inizio dello sviluppo, l'embrione ha già avuto due divisioni e sarà composto da 4 cellule, chiamate blastomeri. Sia il numero di blastomeri che il loro aspetto in questo momento saranno decisivi per la classificazione. L'osservazione di un numero di cellule inferiore o superiore a 4 è indicativa di uno sviluppo ritardato o accelerato. L'osservazione degli embrioni in questa fase dovrebbe essere fatta tra le 44 e le 45 ore dopo l'emancipazione, prestando attenzione al numero e alla simmetria dei blastomeri, al numero di nuclei (ogni cellula deve avere un solo nucleo), al tasso di frammentazione, alla presenza di vacuoli e alla forma della zona pellucida.
Per analizzare la qualità embrionale il terzo giorno, gli embrioni vengono valutati tra le 68 e le 69 ore dopo la nascita. A questo punto vengono analizzati gli stessi parametri che sono stati considerati nel secondo giorno di sviluppo, così come il ritmo di divisione. Gli embrioni della migliore qualità saranno quelli con 7-8 cellule da embrioni a 4 cellule il giorno 2. Gli embrioni possono essere trasferiti in questo momento dello sviluppo o conservati in incubatrice fino al 5 o 6° giorno per il trasferimento in fase di blastocisti.
Il quarto giorno: la morula
Dal quarto giorno di sviluppo si verifica il fenomeno della compattazione per formare una morula. È un processo attraverso il quale le cellule dell'embrione formano legami stretti tra loro e l'embrione assume l'aspetto di una mora. Anche se alcuni embrioni possono mostrare segni di compattazione all'inizio del terzo giorno, la morula è di solito osservata tra le 90 e le 94 ore dopo la semina. Questo momento fornisce poche informazioni sullo stato dell'embrione, dato che da quando tutte le sue cellule sono state compattate non è possibile contarle o osservare altre caratteristiche distintive.
L'evoluzione in blastocisti
Tra 114 e 118 ore (5° giorno) o 136-140 ore (6° giorno) post-seminazione ci troviamo di fronte ad una blastocisti, l'ultimo stadio dello sviluppo embrionale che può avvenire in laboratorio. La formazione della blastocisti è essenziale per l'impianto dell'embrione nell'utero, quindi la sua formazione in coltura è considerata di buona prognosi. Questi embrioni hanno due strutture chiave nella loro morfologia: la massa della cellula interna (MCI), che darà origine agli strati embrionali, e il trofoectoderma o massa della cellula esterna, che darà origine alla placenta.
Come nasce un embrione
Per valutare la qualità delle blastocisti vengono presi in considerazione parametri simili a quelli proposti da Gardner nel 1998: il grado di espansione, lo stato della MCI e lo stato del trofoectoderma. Anche lo spessore della zona pellucida è importante: una zona pellucida fine è legata ad una buona qualità embrionale e ad un'alta probabilità di impianto.
Categorie di qualità embrionale e classificazione
Attualmente gli embrioni sono classificati per categoria in base alla loro qualità morfocinetica. Sia gli embrioni del terzo giorno che le blastocisti possono essere classificati, ma in modo diverso. Per gli embrioni al giorno 2 o 3, si utilizzano le categorie:
- Categoria A o 1: embrioni di ottima qualità, con la massima capacità di impianto.
- Categoria B o 2: embrioni di buona qualità con elevata capacità di impianto.
- Categoria C o 3: embrioni di qualità intermedia, con una capacità di impianto media.
- Categoria D o 4: embrioni di scarsa qualità con bassa capacità di impianto.
Per valutare le blastocisti, la consueta classificazione embrionale ha un numero (da 1 a 5, che indica il grado di espansione) e 2 lettere (la prima per la massa cellulare interna, la seconda per il trofoectoderma). L'Associazione per lo Studio della Biologia della Riproduzione (ASEBIR) ha inoltre proposto una nuova classificazione embrionale che dà maggior peso alla morfologia del trofoectoderma rispetto a quella della massa cellulare interna.
La crioconservazione e il futuro della coltura
La crioconservazione degli embrioni è stata una delle rivoluzioni più significative nel campo della riproduzione assistita. I primi embrioni umani sono stati congelati utilizzando il metodo del congelamento lento, che consisteva nel raffreddare progressivamente le cellule per evitare la formazione di cristalli di ghiaccio dannosi. A partire dagli anni 2000 è stata introdotta la vitrificazione, una tecnica di congelamento ultraveloce che impedisce la formazione di cristalli e trasforma il liquido intracellulare in uno stato vetroso.
Negli ultimi anni è stata introdotta una nuova tecnica: l’ultra-vitrificazione, una versione migliorata della vitrificazione convenzionale. Questo metodo utilizza velocità di raffreddamento ancora più elevate (superiori a 20.000 °C al minuto) e volumi estremamente ridotti di crioprotettore. Ciò riduce al minimo la tossicità cellulare e massimizza la vitalità embrionale, in particolare negli embrioni al quinto giorno (blastocisti), che sono più sensibili allo stress criogenico. Presso il Centro Palmer, gli incubatori cellulari sono dotati di tecnologia in grado di mimare le condizioni che un embrione incontrerebbe all’interno del corpo umano. Realizzare la coltura degli embrioni per cinque giorni consente di selezionare in maniera più efficace gli embrioni che hanno maggiori potenzialità di attecchire nell’utero. Oltre alla selezione dell’embrione, il trasferimento al 5º giorno presenta un altro vantaggio: la sincronizzazione endometrio-embrione. È importante tenere conto del fatto che la valutazione degli embrioni è spesso soggettiva, per cui possono esserci variazioni tra i laboratori. Il fattore maschile è direttamente coinvolto nel 47% dei casi di sterilità e nel 30% dei casi di infertilità, ed è per questo che la diagnosi accurata rimane il pilastro fondamentale di ogni percorso di fertilità.