Le cellule mononucleate del sangue periferico, spesso indicate con l'acronimo PBMC, rappresentano un campo di studio e applicazione in costante evoluzione nel panorama della ricerca biotecnologica e biomedica. Il sangue periferico è il sangue che entra nei vasi sanguigni dopo la sua formazione nel midollo osseo e vi circola, fungendo da mezzo di trasporto essenziale per numerosi componenti vitali. All'interno di questo sistema circolatorio, le PBMC si distinguono per la loro morfologia caratteristica e il loro ruolo multifunzionale.
Cosa Sono le PBMC? Definizione e Componenti
Una cellula mononucleare del sangue periferico (PBMC) è una cellula del sangue con un singolo nucleo rotondo. Queste cellule, talvolta indicate come PMNC (cellule mononucleari periferiche) o MNC (cellule mononucleari), comprendono tutti i leucociti mononucleati. I componenti principali del sangue periferico sono il plasma sanguigno, che funge da mezzo di trasporto, i globuli rossi e il sangue di origine animale. Le PBMC sono costituite specificamente da linfociti (come cellule T, cellule B, e cellule NK) e monociti. I macrofagi, ad esempio, sono cellule mononucleate del tessuto che incorporano nel loro citoplasma particelle estranee e microrganismi per distruggerli (fagocitosi), e derivano dai monociti. Le cellule mononucleate periferiche del sangue, in breve PBMC, sono cellule mononucleate del sangue con un nucleo rotondo.
Queste cellule sono ampiamente utilizzate nel campo dell'immunologia, della terapia cellulare, delle malattie infettive e dello sviluppo di vaccini, grazie alla loro facilità di isolamento e alla loro composizione eterogenea, che le rende un modello prezioso per studiare l'effetto dei bioattivi alimentari su varie cellule immunitarie. È importante notare che la composizione, il fenotipo e lo stato di attivazione delle PBMC possono differire da quelli delle cellule presenti in specifici tessuti, come il tessuto intestinale, dove molti tipi di cellule sono coinvolti nel mantenimento del tessuto, con i principali attori rappresentati dalle cellule epiteliali di rivestimento e dal sistema immunitario.
Il Processo di Isolamento delle PBMC: Centrifugazione a Gradiente di Densità
Il termine PBMC (cellule mononucleari del sangue periferico) è strettamente legato all'accumulo di cellule provenienti da purosangue per mezzo di un centrifugazione a gradiente di densità. Le PBMC vengono spesso elaborate per separarsi dal sangue intero mediante centrifugazione in gradiente di densità. La separazione dei componenti del sangue è possibile in quanto hanno densità diverse; ciò avviene mediante centrifugazione in un'unica fase in un adeguato mezzo a gradiente di densità. Il cut-off per le cellule mononucleari è 1,077 g/ml. I leucociti polimorfonucleati (con nuclei multipli segmentati), come i granulociti, sono impoveriti nei PBMC. I granulociti neutrofili ed eosinofili non possono quindi essere arricchiti da una frazione di PBMC preparata mediante separazione standard in gradiente di densità (il mezzo ha una densità di 1,077 g/ml). I granulociti basofili differiscono per densità e possono essere parzialmente trovati nella frazione di PBMC.
Il processo inizia con l'applicazione accurata del sangue intero o del materiale campione a una soluzione di polimero sintetico con una densità definita, che viene sovrapposta in una provetta da centrifuga. Occorre fare attenzione che i due liquidi non si mescolino. In alternativa, si possono usare le provette pluriMate. Dopo la preparazione, viene eseguita una fase di centrifugazione. Le cellule si accumulano nell'interfase tra le due soluzioni alla densità corrispondente. L'interfase contenente le PBMC viene accuratamente rimossa. Le PBMC arricchite dal gradiente di densità sono talvolta indicate come buffy coat. In questo contesto, il buffy coat descrive lo strato di leucociti arricchiti nell'interfase. In questo caso particolare, le PBMC, il buffy coat è costituito solo da cellule mononucleate ed è in questo senso un buffy coat speciale. Queste cellule sono facilmente isolabili dal sangue di donatori sani o da buffy coat (concentrati di leucociti, un sottoprodotto delle banche del sangue degli ospedali nella produzione di globuli rossi e concentrati di trombociti dal sangue intero anticoagulato). Il monitoraggio e l'analisi della vitalità e della concentrazione di PBMC sono fondamentali per i laboratori clinici, la ricerca scientifica medica di base e la produzione di cellule immunitarie.
Le Proprietà Rigenerative e Immunomodulatorie delle PBMC
Le cellule mononucleate, o cellule nucleari totali, sono cellule staminali mesenchimali coinvolte nei processi di rigenerazione e riparazione dei tessuti. Sono cellule primitive e non specializzate che hanno la capacità di trasformarsi in diversi tipi di cellule dell’organismo. Diversi studi scientifici e clinici hanno dimostrato che, se iniettate in una lesione cartilaginea, hanno grandi proprietà rigenerative. Le cellule mononucleate da sangue periferico si ottengono grazie ad un prelievo di sangue periferico, luogo dove risiedono monociti e linfociti, attraverso un sistema di filtrazione per dimensione. Queste cellule si occupano con successo e con una notevole velocità di rispondere al danno tissutale e procedere alla rigenerazione dello stesso.
Le PBMC sono composte da linfociti e monociti, che inducono angiogenesi e arteriogenesi secernendo citochine e fattori di crescita, e contribuiscono all'infiammazione e alla rigenerazione dei tessuti. Monociti e macrofagi sono coinvolti nella vascolarizzazione post-ischemica in regioni ipossiche, regolata dal fattore inducibile dall'ipossia (HIF)-1. Questa combinazione di capacità immunomodulatorie e rigenerative rende le PBMC candidati ideali per una vasta gamma di applicazioni terapeutiche.
PBMC Autologhe ed Eterologhe: Distinzioni Fondamentali e Implicazioni Terapeutiche
La distinzione tra cellule autologhe ed eterologhe è cruciale in medicina rigenerativa e terapia cellulare, con profonde implicazioni per il trattamento di diverse patologie. Le PBMC autologhe sono cellule prelevate dallo stesso paziente che le riceverà come trattamento, minimizzando il rischio di rigetto immunitario. Le PBMC eterologhe, al contrario, provengono da un donatore differente dal ricevente, introducendo la complessità della compatibilità immunologica e la potenziale necessità di immunosoppressione.
Trattamento dell'Ischemia Critica degli Arti Inferiori (ICAI) con PBMC Autologhe
Un esempio significativo dell'applicazione delle PBMC autologhe si riscontra nel trattamento dell'Ischemia Critica degli Arti Inferiori (ICAI), la forma più grave di malattia arteriosa periferica, caratterizzata da ulcere e cancrena, che porta all'amputazione e alla morte. L'impianto di cellule con elevata capacità angiogenica e vasculogenica rappresenta un promettente approccio per trattare la ICAI. Molti studi confermano la sicurezza e l'efficacia delle cellule del midollo osseo e delle PBMC. Un vantaggio delle PBMC è la facile raccolta di sangue, rispetto al prelievo invasivo del midollo osseo, rendendo le PBMC un valido candidato.
Lo scopo di un progetto recente era sviluppare un nuovo prodotto di PBMC autologhe per trattare pazienti affetti da ICAI che non sono idonei per la rivascolarizzazione. La fase preclinica ha mirato a stabilire i protocolli di isolamento, crioconservazione e scongelamento, per massimizzare il numero e la vitalità delle PBMC. Il sangue anticoagulato è stato processato entro 8 ore per isolare le PBMC mediante centrifugazione in gradiente di densità. La crioconservazione ottimale è stata ottenuta con l'11% di DMSO nel mezzo di congelamento e con un programma di congelamento controllato. L'immunofenotipizzazione mediante citometria a flusso ha fornito il numero assoluto di tutti i tipi di cellule nel prodotto. Per migliorare l'attività funzionale delle PBMC, è stato eseguito un condizionamento ipossico con un sistema economico ed efficiente. Un condizionamento di 24 ore a una densità di 5 x 10^6 cellule/ml non ha alterato la qualità delle PBMC, determinata mediante ispezione visiva, conteggio delle cellule, vitalità e immunofenotipizzazione in colture normossiche o ipossiche. La funzionalità delle cellule condizionate è stata valutata con test di adesione e migrazione, sopravvivenza e produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) dopo stress ossidativo, e l’espressione di mRNA di geni rilevanti. L'ipossia ha aumentato la capacità di adesione e di migrazione delle PBMC e il loro tasso di sopravvivenza dopo lo stress ossidativo. Livelli simili di ROS sono stati misurati dopo la coltura in entrambe le condizioni, e un aumento significativo è stato indotto dallo stress ossidativo solo nelle cellule normossiche. L’analisi delle PBMC ipossiche ha evidenziato un significativo aumento nell’espressione del fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF), la citochina più importante nella formazione di nuovi vasi sanguigni.
Come isolare i PBMC dal sangue intero utilizzando la centrifugazione in gradiente di densità (Fic...
I parametri rilevanti della catena di produzione richiedevano una validazione, per implementare il processo in un impianto conforme alle norme GMP (Good Manufacturing Practice) e chiedere l'autorizzazione alla produzione. Le condizioni ottimali di conservazione e trasporto del sangue sono state confermate a temperatura ambiente per un massimo di 8 ore. L'isolamento, la crioconservazione e lo scongelamento delle PBMC sono stati eseguiti in camera bianca secondo le istruzioni di produzione. Resa, vitalità e percentuali di recupero erano coerenti con il processo di ricerca. La conservazione a lungo termine delle cellule congelate in azoto liquido ha confermato alte percentuali di recupero e vitalità delle cellule scongelate per 12 mesi. Le PBMC risospese in 5% di albumina umana si sono rivelate stabili fino a 24 ore se conservate e trasportate a 4°C. Questo sviluppo di nuovi prodotti per terapia cellulare autologa, come dimostrato in ricerche pubblicate nel 2021, evidenzia il potenziale e la complessità di tali approcci.
PBMC Eterologhe e la Ricerca sull'HIV: Il Caso del "Paziente di Berlino" e dei "Pazienti di Boston"
La ricerca sull'HIV ha offerto un terreno fertile per esplorare le potenzialità e le sfide delle PBMC eterologhe, in particolare nel contesto del trapianto di cellule staminali. Da quando si è avuta conferma che il trapianto di Timothy Ray Brown, il Berlin Patient, aveva curato non soltanto la sua leucemia, ma anche l'infezione da HIV, molti gruppi di ricerca hanno cercato di spiegare a quale fra i diversi meccanismi intervenuti in questo straordinario successo si potesse attribuire il merito dell'eradicazione del virus. Ad oggi, Timothy Brown continua ad essere l'unica persona sicuramente guarita dall'HIV, ma meno sicure sono le ragioni per le quali è guarito. Fu grazie al regime di condizionamento prima del trapianto, soprattutto l'irradiazione "total body", che distrusse tutte le - o almeno la maggior parte delle - cellule che contenevano HIV? Fu grazie al limitato effetto di "graft versus host", che le cellule del donatore estraneo scatenarono contro alcune cellule del suo corpo, in particolare quelle contenenti virus che erano rimaste in circolazione dopo il condizionamento? Molto probabilmente fu un concatenarsi di diversi meccanismi a portare al successo del Berlin Patient. Ma da quando sappiamo che Timothy è guarito molti gruppi di scienziati hanno cercato di capire il perché, così da poter replicare quell'unico successo. Probabilmente tutto quello che quel genio di Gero Hütter ha fatto per guarire Timothy è stato importante e forse un ruolo l'ha giocato anche il caso - o la fortuna.
Il caso di Timothy Ray Brown ha coinvolto staminali eterologhe, provenienti da un donatore con una rara mutazione genetica (CCR5Δ32) che conferisce resistenza all'HIV. Questa mutazione impedisce al virus di entrare nelle cellule ospiti.La bassa prevalenza mondiale di donatori di cellule staminali che presentano la delezione Δ32 ha spinto dunque diversi ricercatori verso il campo dell'editing genetico, che permette di prelevare da una persona le sue stesse staminali, modificarle e reinfonderle, combinando l'approccio autologo con la specificità genetica del successo eterologo.
Un'altra esperienza rilevante è quella dei "Boston Patients". Hanno ricevuto entrambi un trapianto con staminali non difettive, sono stati mantenuti in terapia antiretrovirale (ART) prima, durante e dopo il trapianto e, quando hanno sospeso la ART, hanno mantenuto la viremia irrilevabile per settimane e addirittura mesi. Naturalmente, poiché da tutte le indagini fatte pareva proprio che di virus non ne ospitassero più, il rebound delle viremie ha provocato una delusione tremenda in tutti. Ma la parte bella di questa esperienza consiste nel fatto che il trapianto, eseguito con la presenza continua e prolungata della ART, ha causato una riduzione molto grande del reservoir latente, molto più grande di quella causata da tutti gli altri tentativi di eradicazione, che siano shock and kill o anticorpi o altro. Tanto grande da aver consentito ai due pazienti di controllare da soli il virus per molto più tempo delle due settimane che ci attendiamo in media prima del rebound.
Gli studiosi spagnoli guidati da Javier Martinez-Picado, che hanno pubblicato sugli Annals of Internal Medicine un articolo sui meccanismi che contribuiscono a una profonda riduzione del reservoir di HIV-1 dopo il trapianto allogenico di cellule staminali, hanno lavorato sull'esperienza dei Boston Patients. Il loro è un piccolo studio retrospettivo, fatto su sole 6 persone e in cui è mancata la prova regina della sospensione della ART. Quindi quel che ci raccontano nell'articolo deve essere scisso in una parte di dati e una parte di speranze. E quel che hanno visto, misurandolo con dei test che erano più sensibili di quelli usati nel caso dei Boston Patients e dei trapianti precedenti, è che i reservoir di tutti e 6 i pazienti si sono ridotti così tanto che, in 5 casi su 6, non li si riesce più a trovare. Dal punto di vista anticorpale, in tutti i livelli degli anticorpi anti-HIV sono diminuiti - una chiara indicazione del fatto che lo stimolo agli anticorpi dato dagli antigeni virali è venuto in gran parte meno. In un caso, in cui il trapianto è stato fatto ormai 8 anni fa, si è addirittura verificata la sieroreversione: da positivo a negativo. Il fatto di non riuscire a trovare DNA virale, ha spinto i ricercatori a tentare di infettare dei topi immunodeficienti con cellule prelevate dai pazienti e, mentre i topi sfidati con cellule prelevate a un paziente in ART si sono infettati, quelli in cui sono state iniettate cellule dei pazienti trapiantati no. Si può dire che i 5 pazienti in cui non si riesce a trovare virus siano guariti? Questa è ovviamente la speranza di Martinez-Picado e colleghi (e di tutti noi). È una speranza fondata, se teniamo conto che il rebound delle viremie nei Boston Patients si è avuto a partire da una sola cellula infetta? È presto per dirlo. Il fatto è che lo studio spagnolo ha preso in considerazione pochissime persone e ciascuna di queste ha avuto reazioni contro il tumore/l'HIV assai diverse e anche diversi regimi di profilassi contro la Graft, oltre che regimi di condizionamento pre-trapianto differenti. E poi, naturalmente, vale il solito discorso che si fa dai tempi di Timothy Brown: procedure così pesanti si possono attuare solo quando c'è in gioco la vita per un tumore.
L'Editing Genetico di PBMC Autologhe per la Cura dell'HIV
La bassa prevalenza di donatori CCR5Δ32 ha spinto la ricerca verso l'editing genetico delle staminali autologhe. Gli altri (pochissimi) trapianti con staminali CCR5Δ32 in persone con HIV si sono conclusi tragicamente, con la morte del paziente o per GvHD, o per una recidiva del cancro, o per infezioni intervenute prima della ricostituzione del sistema immunitario. Abbiamo però avuto studi - alcuni, ancora in corso, daranno risposte nei prossimi anni - che hanno mantenuto ferme tutte le condizioni e fatto variare solo una, indagando ad esempio che cosa accade se si trapiantano staminali autologhe e non eterologhe, ma geneticamente modificate così da renderle CCR5 negative, con regimi di condizionamento leggeri e ovviamente nessuna possibilità di Graft vs HIV.
Un esempio promettente viene dai risultati di una sperimentazione fatta dal team di Hans-Peter Kiem al Fred Hutchinson su scimmie e presentata a IAS 2015: "Zinc finger nuclease gene editing for functional cure in a nonhuman primate model of HIV/AIDS". Nello studio pilota che presentarono allo IAS tre anni fa, Kiem e colleghi avevano già dimostrato che il trapianto autologo di staminali modificate in un modello di scimmie è sicuro e comporta un attecchimento duraturo della progenie di quelle staminali. Hanno dunque impostato una sperimentazione molto complessa, in cui le staminali autologhe rese CCR5Δ32 usando le ZFN sono state trapiantate o prima o dopo aver infettato i 31 macachi con SHIV e i diversi gruppi sono serviti come controlli gli uni per gli interventi degli altri. Questi dati suggeriscono dunque che l'editing del gene ccr5 sia ugualmente fattibile negli animali con o senza l'infezione e che le cellule modificate persistano allo stesso modo negli animali infetti e non infetti.
Negli animali in cui il trapianto è stato fatto prima che venissero infettati, i livelli di DNA e RNA virale nel tratto gastrointestinale e nei linfonodi sono risultati simili a quelli presenti negli animali non trapiantati di controllo; invece negli animali dei gruppi B e C, che hanno ricevuto le staminali modificate dopo che l'infezione era stata messa sotto controllo grazie alla ART, si è vista una diminuzione del DNA virale nei linfonodi dopo il trapianto e prima dell'interruzione della ART. Inoltre, i CD4 della memoria centrale localizzati nell'intestino sono diminuiti subito prima del trapianto, ma subito dopo sono aumentati ed erano CCR5 negativi. Il trapianto con staminali autologhe NON modificate (CCR5 wild type) non ha avuto un effetto significativo sulle dimensioni del reservoir di SHIV nei CD4 del sangue periferico. Invece, negli animali che hanno ricevuto il trapianto con staminali difettive si è potuta misurare una significativa diminuzione dei livelli di DNA e di RNA virale nei tessuti. Kiem e colleghi stanno dunque approntando delle condizioni di coltura tali da aumentare l'efficienza dell'editing delle staminali, così da permettere alla progenie di cellule CCR5 negative, che si sono confermate avere un vantaggio selettivo sulle CCR5 positive, di persistere più a lungo e in quantità maggiori. L'idea con cui i ricercatori del Fred Hutchinson Cancer Research Center concludono questo lavoro è che strategie di editing più efficienti che comportino una consistente diminuzione delle cellule del reservoir potrebbero essere rese ancor più efficaci se combinate con strategie che colpiscano attivamente le cellule latentemente infette (cioè le strategie anti-latenza) e/o il miglioramento della risposta immunitaria a fronte di un ripresentarsi della viremia per il risveglio del reservoir.
Prodotti Medicinali per Terapie Avanzate (PMTA) e Buone Pratiche di Fabbricazione (GMP)
Gli ultimi anni sono stati caratterizzati da una rivoluzione nella ricerca biotecnologica e biomedica. Un ruolo cruciale in questo processo è dovuto ai medicinali per terapie avanzate (PMTA), che includono terapie geniche, terapie cellulari e prodotti di ingegneria tissutale. Le linee guida sulle buone pratiche di fabbricazione (GMP) garantiscono qualità, sicurezza ed efficacia dei PMTA regolando il ciclo di vita di un prodotto. Questo è fondamentale per assicurare che le PBMC, sia autologhe che eterologhe, utilizzate in contesti clinici siano di altissima qualità e conformi agli standard normativi più stringenti. La necessità di tali standard è evidente quando si considera la complessità della preparazione e manipolazione di queste cellule per applicazioni terapeutiche, come dimostrato nell'esempio dello sviluppo di prodotti di PBMC autologhe per la ICAI.
Altre Fonti di Cellule Rigenerative e il Confronto con le PBMC
Oltre alle PBMC, altre fonti di cellule hanno dimostrato un potenziale significativo nella medicina rigenerativa. Il plasma ricco di piastrine (PRP) è definito come una frazione plasmatica, ottenuta mediante un processo di centrifugazione e separazione, con una concentrazione di piastrine superiore ai livelli di base. Queste piastrine contengono fattori di crescita che possono intervenire favorevolmente nei processi di guarigione attirando cellule indifferenziate dalla matrice e favorendo la replicazione cellulare. L’uso delle cellule staminali derivate dal midollo osseo o dal tessuto adiposo per accelerare la guarigione dei tessuti è ampiamente descritto in letteratura. Il concentrato autologo di midollo osseo o del tessuto adiposo contiene cellule mesenchimali pluripotenti, in grado di differenziarsi in diverse linee cellulari. Diversi studi dimostrano una riduzione dell’infiammazione e un’accelerata rigenerazione tissutale. Mentre queste opzioni offrono vie terapeutiche diverse, le PBMC si distinguono per la facilità di raccolta, che le rende un'alternativa meno invasiva rispetto al prelievo di midollo osseo, mantenendo al contempo un notevole potenziale rigenerativo e immunomodulatorio.
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