La Fecondazione in Vitro e la Corsa contro l'Estinzione del Rinoceronte Bianco Settentrionale

Nel panorama delle specie minacciate, il rinoceronte bianco settentrionale (Ceratotherium simum cottoni) occupa una posizione di drammatica urgenza, essendo considerato il mammifero più a rischio di estinzione al mondo. La sua condizione è così critica che, come si dice in gergo tecnico, la specie è già funzionalmente estinta. Non è più presente al mondo un maschio capace di continuare la discendenza, e gli ultimi esemplari viventi, due femmine di nome Najin e Fatu, risiedono presso l'Ol Pejeta Conservancy in Kenya. Questa situazione ha spinto un gruppo internazionale di ricercatori a ricorrere a tecniche di riproduzione assistita, un'iniziativa senza precedenti per cercare di salvare la specie dalla scomparsa definitiva dal pianeta.

La Crisi del Rinoceronte Bianco Settentrionale: Una Specie Funzionalmente Estinta

La storia recente del rinoceronte bianco settentrionale è segnata da un declino precipitoso. Negli anni Sessanta, si contavano ancora circa duemila individui. Tuttavia, tra bracconaggio, guerre e una progressiva perdita degli habitat naturali, il numero di questi maestosi animali è sceso drammaticamente fino alla situazione odierna. L'ultimo maschio della specie, chiamato Sudan, è morto di vecchiaia a marzo. Viveva insieme alle ultime due compagne della stessa specie, Najin e Fatu, nella riserva di Ol Pejeta Conservancy. Purtroppo, nonostante gli sforzi, non hanno mai generato prole naturalmente. Di fatto, dopo la morte dell'unico maschio vivente rimasto, Sudan, di cui si è avuta notizia, il mondo si è trovato con solo due esemplari femmine. Nel 2009 ne rimanevano solo 4 esemplari, due maschi e due femmine, nello zoo di Dvur Kralové nella Repubblica Ceca. Gli esemplari quell'anno furono trasferiti nella riserva kenyana di Ol Pejeta, nella speranza che si riproducessero, ma senza successo. Uno dei maschi, Suni, è morto nel 2014, l'altro, Sudan, è morto. Restano solo due femmine di questa specie, Najin (sorella di Sudan) e Fatu, figlia di Najin, entrambe incapaci di riprodursi naturalmente, consolidando la condizione di estinzione funzionale.

Il Progetto BioRescue e il Ruolo Pionieristico di Avantea

Per affrontare questa sfida particolarmente complessa, è stato lanciato il progetto BioRescue, un'iniziativa internazionale che unisce ricercatori pubblici e privati da Germania, Giappone, Repubblica Ceca e Italia. Il consorzio di scienziati, del quale fa parte anche l'italiana Avantea guidata di Cesare Galli, ha assunto un ruolo centrale in questo sforzo conservativo. AVANTEA è un leading partner del progetto BioRescue, con il Prof. Cesare Galli e la Dr.ssa Silvia Colleoni alla guida.

Il programma di ricerca BioRescue è finanziato dal Ministero della Pubblica Istruzione tedesco e ricerca (BMBF), e include partner chiave come l'Istituto Leibniz Zoo and Wildlife Research (IZW) di Berlino (il gruppo di ricerca internazionale è guidato da Thomas Hildebrandt dell'IZW), lo zoo di Dvůr Králové, l'Ol Pejeta Conservancy e il Kenya Wildlife Service. L'intervento del laboratorio di tecnologie avanzate per la riproduzione animale e la ricerca biotecnologica Avantea, un'azienda cremonese guidata da Cesare Galli che per prima al mondo ha clonato un toro, Galileo, e una cavalla, Prometea, si è dimostrato cruciale. L'articolo scientifico dal titolo “In vitro fertilization program in white Rhinoceros”, pubblicato nell’Ottobre, dalla rivista Reproduction, ha ricevuto il prestigioso premio per la miglior ricerca pubblicata dalla Society for Reproduction and Fertility per il suo studio sulle tecnologie di riproduzione assistita (aART) nei rinoceronti bianchi. Questo riconoscimento sottolinea l'importanza e l'innovazione degli approcci adottati.

Tecnologie di Riproduzione Assistita (aART): Ovum Pick-Up e Fecondazione In Vitro

La strategia per salvare il rinoceronte bianco settentrionale si basa sull'applicazione e l'adattamento di tecniche di riproduzione assistita (aART). Il team del progetto BioRescue ha dimostrato che procedure come l'ovum pick-up (OPU) e la fecondazione in vitro (IVF) sono sicure per le femmine di rinoceronte, hanno effetti positivi sulla fertilità e portano alla produzione di embrioni vitali. Per la prima volta, adattando metodi usati per la fecondazione assistita dei cavalli, sono stati creati in provetta embrioni di rinoceronte.

La Avantea, l’azienda cremonese guidata da Cesare Galli, si è specializzata nella riproduzione animale, con una expertise riconosciuta a livello mondiale. "Stiamo lavorando da anni sui rinoceronti bianchi settentrionali. Le tecniche di fecondazione in vitro non sono mai state applicate per quella specie. Stiamo facendo esperimenti sulla specie simile, il rinoceronte bianco meridionale, negli zoo europei", ha spiegato Cesare Galli. Il processo prevede il prelievo di ovuli dalle due femmine sopravvissute, la fecondazione di questi con lo sperma congelato e l'impianto degli ovuli fecondati in "madri surrogate". Gli ovociti vengono presi da Fatu, l’unica femmina che dà ancora ovuli vitali, di questa sottospecie annientata dal bracconaggio. I laboratori Avantea di Cremona, in collaborazione con l’Università di Padova, sono gli unici che riescono a creare embrioni da questa specie. "Dall’unica femmina che dà degli ovuli vitali, che è Fatu, vengono prelevati gli ovociti in Kenya che poi vengono portati qui a Cremona e noi facciamo gli embrioni che vengono congelati," ha affermato Galli, sottolineando la complessa logistica. "Al Kenyan Wildlife Service abbiamo chiesto una maggiore disponibilità di femmine, perché è una questione anche di numeri, un po’ di fortuna, ma anche di numeri."

La Creazione di Embrioni: Una Riserva Genetica Cruciale

Un traguardo significativo è stata la produzione di 35 embrioni di rinoceronte bianco settentrionale, di cui 5 nel 2024, nei laboratori di Avantea. Questi embrioni sono stati ottenuti utilizzando il seme dei due maschi deceduti Suni e Angalifu e gli ovociti prelevati da Fatu. Questa operazione ha permesso di creare una riserva genetica di fondamentale importanza per la salvezza della specie. Continuano i tentativi per salvare dall’estinzione il rinoceronte bianco settentrionale. Per la fecondazione delle uova di Najin e Fatu, a tre giorni dal prelievo, è stata utilizzata la tecnica ICSI (Intra Citoplasma Sperm Injection), con sperma congelato di due Rinoceronti Bianchi Settentrionali, Suni e Saut, morti nel 2014 e nel 2018. Questa tecnica consiste nell'iniettare gli spermatozoi direttamente nella cellula uovo. Simile a quella impiegata nell'uomo, è stata prima modificata per essere utilizzata nei cavalli e poi riadattata alle esigenze dei rinoceronti. Cesare Galli di Avantea, che ha guidato la procedura di fecondazione, ha affermato: “Siamo rimasti sorpresi dall'elevato tasso di maturazione raggiunto, in quanto non otteniamo un tasso così elevato (paragonabile a quello che otteniamo con gli ovociti di cavallo) con femmine di rinoceronte bianco meridionale negli zoo europei. Il seme di Saut era molto difficile da lavorare, e per trovare tre spermatozoi vivi è stato necessario scongelare due partite di seme. Ora gli ovociti vengono incubati e dobbiamo aspettare lo sviluppo di un embrione vitale che possa essere crio-conservato per i successivi trasferimenti”.

In un'altra serie di esperimenti, nel laboratorio cremonese di Avantea, specializzato nelle tecnologie di riproduzione assistita per animali di grossa taglia, i ricercatori hanno fatto maturare 30 ovociti prelevati da femmine di rinoceronte bianco meridionale. Di questi, 17 sono stati fecondati con il seme della stessa sottospecie, mentre gli altri 13 sono stati fecondati con lo sperma congelato di esemplari deceduti di rinoceronte bianco settentrionale. Sono stati così ottenuti sette embrioni di rinoceronte, bloccati a 12 giorni di sviluppo: alcuni sono stati congelati, in attesa del trapianto nell'utero di madri surrogate, mentre altri sono stati usati per ottenere cellule staminali, preziose per testare tecniche con cui produrre nuovi gameti che permettano di aumentare la diversità genetica dei rinoceronti.

Il Primo Trasferimento Embrionale e le Madri Surrogate

Un altro traguardo significativo è stato il primo trasferimento embrionale riuscito: un embrione di rinoceronte bianco meridionale, prodotto in vitro, è stato trasferito in una madre surrogata presso l’Ol Pejeta Conservancy in Kenya, portando a una gravidanza confermata. Questo successo è un passo fondamentale, in quanto dimostra la fattibilità dell'intero processo. Il piano prevede ora di trasferire gli embrioni in femmine di rinoceronte meridionale, che faranno da madri surrogate per portare avanti la gravidanza e, possibilmente, far nascere i piccoli. Queste madri surrogate sono femmine di rinoceronte bianco meridionale, una specie simile che vive in Sudafrica e della quale sono rimasti circa 20mila esemplari. "Ci sono molti esemplari della varietà del Sud negli zoo europei, e questo semplificherebbe l’operazione," spiega Galli. Il successo dell'impianto dipende anche dal calore delle femmine. Nel recinto c’è un maschio di rinoceronte che è vasectomizzato, quindi si accoppia con la femmina ma non ingravida, un metodo che segnala agli operatori in campo quando la femmina è in calore. "Più invecchia Fatu," ha spiegato Galli, "meno probabilità ci sono che faccia l’embrione, perché con l’avanzamento dell’età si riduce la fertilità, per cui le priorità sono due: una è continuare a prelevare ovuli da Fatu e stoccare embrioni, e l’altra è quella di impiantare questi embrioni che produciamo."

Embrioni Ibridi e Test di Fattibilità Iniziali

Inizialmente, i ricercatori hanno scelto di creare due embrioni “ibridi”, prodotti unendo in provetta campioni di sperma congelato di rinoceronti settentrionali e ovociti di una sottospecie parente, il rinoceronte bianco meridionale, che non è in pericolo (circa ventimila individui vivono ancora in Africa). In questo modo, hanno innanzitutto cercato di dimostrare la fattibilità dell’utilizzo delle tecniche di riproduzione assistita con un animale come il rinoceronte, su cui non erano mai state tentate. Gli ovociti usati sono stati prelevati da femmine di rinoceronte bianco meridionale che vivono in zoo europei, adattando le tecniche in uso per la riproduzione assistita dei cavalli. Poi sono stati spediti a Cremona, ad Avantea, il laboratorio di tecnologie avanzate per la riproduzione animale diretto da Cesare Galli. I risultati dimostrano che la riproduzione artificiale "è un'opzione scientificamente valida, una strada percorribile non solo per gli animali di allevamento, ma anche per specie selvatiche a rischio estinzione," ha spiegato Galli. "Ora attendiamo il via libera dalle autorità del Kenya per raccogliere ovociti dalle ultime due femmine di rinoceronte bianco settentrionale e produrre embrioni puri."

La Strada delle Cellule Staminali: Ampliare la Diversità Genetica

Tuttavia, la corsa contro il tempo per il rinoceronte bianco settentrionale presenta ancora sfide complesse, in particolare per quanto riguarda la diversità genetica. Poiché i campioni di sperma crioconservati e utilizzabili per la fecondazione in vitro appartengono a soli quattro maschi di rinoceronte settentrionale, questo numero è troppo esiguo per sperare di ridare vita a una popolazione con sufficiente diversità genetica. "Lavoriamo con quel poco che è rimasto," spiega Galli. "Abbiamo lo sperma congelato di tre esemplari morti, ma è di cattiva qualità, si può usare solo per la fecondazione in vitro. Abbiamo ancora due femmine, madre e figlia, entrambe infertili."

Per superare questo ostacolo, i ricercatori hanno in mente di battere anche un’altra strada più avveniristica: quella delle cellule staminali. L’idea è di creare i gameti, spermatozoi e ovociti, in laboratorio, a partire da staminali pluripotenti. In pratica, si tratterebbe di ricavare questo tipo di cellule, in grado di dare vita a qualunque tessuto, dalle cellule somatiche (crioconservate) dei rinoceronti estinti, farle differenziare in ovociti e spermatozoi, e sperare così di ricreare una stirpe di questi mammiferi ormai quasi scomparsi dal pianeta. Ad oggi, è possibile, almeno in teoria, utilizzare una cellula adulta della pelle dell’animale, ad esempio, per portarla allo stato di cellula staminale pluri-potente, capace di dare vita a diversi tessuti dell’organismo. Dalla cellula staminale si può ottenere un gamete, cioè un oocita o uno spermatozoo da far accoppiare. A quel punto si avrebbero a disposizione gli ingredienti per creare embrioni a volontà. Tra l’altro, si dispone di una dozzina di campioni di cellule adulte conservati dai rinoceronti maschi defunti.

TUTTAVIA, la tecnologia per «riprogrammare» le cellule è ancora molto sperimentale. Risale al 2006 ed è valsa il premio Nobel al giapponese Yamanaka nel 2012. Finora è stata sperimentata solo sui topi e notoriamente il processo di sviluppo embrionale è molto diverso da specie a specie. In ogni caso, nonostante menzioni questa possibilità, lo studio pubblicato da Nature Communications non rappresenta alcun passo avanti reale in questa direzione.

Prospettive Future, Ostacoli e Dibattiti

La possibilità di produrre in vitro un embrione di Rinoceronte Bianco del Nord, cosa che non è mai stata fatta, per la prima volta è una realtà tangibile", spiega Galli. I risultati sullo sviluppo dell'embrione sarebbero stati annunciati. Prima della procedura finale di 'utero in affitto' "serviranno però nuovi test," precisa Galli, stimando che il cucciolo della speranza potrebbe vedere la luce "entro 3-5 anni."

Per finanziare l’operazione è stata lanciata una raccolta di fondi da Ol Pejeta e dallo zoo di Dvur Kralové. La strada per il successo, tuttavia, è disseminata di ostacoli sia scientifici che logistici e politici. Il problema è che le femmine a disposizione sono solo due, lo sperma piuttosto vecchio e non è detto che l’operazione riesca. "Prendere degli ovuli dalle due femmine del Nord sopravvissute non è impossibile, ma ci vorrebbe l’autorizzazione del Kenya," racconta Galli. "È una questione politica, loro vogliono fare l’operazione là. Si sta cercando un accordo per riuscire a portare questi ovuli in Italia e lavorarci."

Come sottolineano Terri Roth e William Swanson del Centro di conservazione delle specie in pericolo di Cincinnati in un commento, la riproduzione assistita non sarà mai la soluzione definitiva al problema dell’estinzione delle specie. L’esperienza insegna che i risultati sul campo sono inferiori a quelli ottenuti in laboratorio. Finora, nonostante le potenzialità e le aspettative, i successi delle tecnologie di riproduzione assistita per aiutare animali a rischio di estinzione sono stati limitati. Il panda gigante, l’elefante asiatico e il furetto dai piedi neri sono tra i pochi in cui hanno funzionato.

Il Contesto Globale dei Rinoceronti

La drammatica situazione del rinoceronte bianco settentrionale si inserisce in un contesto globale dove la sopravvivenza di tutte le specie di rinoceronti è minacciata. Sono meno di 30.000 i rinoceronti al mondo, suddivisi in cinque specie principali. Di questi, si contano circa 20.000 rinoceronti bianchi meridionali, prevalentemente in Sudafrica. I rinoceronti neri, distribuiti nell'Africa meridionale e orientale, sono circa 5.000. La specie indiana, con un solo corno, conta circa 3.500 esemplari in India e Nepal. Le situazioni più critiche, oltre a quella del rinoceronte bianco settentrionale, riguardano i rinoceronti di Sumatra, con meno di 100 individui, e i rinoceronti di Giava, che ammontano a soli 60 esemplari. Questa panoramica evidenzia l'ampiezza degli sforzi di conservazione necessari a livello mondiale per proteggere questi magnifici animali.

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