Il Siero Bovino Fetale (FBS) è un supplemento ampiamente utilizzato nei mezzi di coltura cellulare, derivato dal sangue di feti bovini. Questo composto si è affermato come una pietra miliare nella preparazione di numerosi prodotti biologici e rappresenta il supplemento più diffuso per il mantenimento in vitro di colture cellulari di cellule eucariote. L'elaborato introduce l'argomento della carne coltivata, riportandone la definizione e una sintetica spiegazione del metodo di produzione, focalizzando l'attenzione sulla metodologia di coltivazione cellulare applicata. È in questo contesto che il siero fetale bovino assume un ruolo di primaria importanza. Il corpo dell'elaborato si incentra, in prima istanza, sulla composizione, metodo di produzione ed efficienza del siero fetale bovino nella crescita cellulare, motivo per il quale è quindi diffuso in larga scala nelle coltivazioni cellulari eucariotiche. Questo supplemento, quando usato a concentrazioni appropriate, fornisce molti componenti definiti e non definiti che si sono dimostrati in grado di soddisfare specifici requisiti metabolici per la coltura delle cellule. La sua efficacia ha contribuito a renderlo uno dei supplementi di gran lunga più popolari nei laboratori di ricerca, e le cellule, infatti, crescono in appositi terreni di coltura che forniscono loro tutte le sostanze necessarie. Tuttavia, il suo impiego presenta dei limiti scientifici che, uniti ad alcune considerazioni di ordine etico, portano molti scienziati a cercare soluzioni alternative, un tema che verrà approfondito nel corso dell'articolo.
1. Siero Fetale Bovino (FBS): Composizione e Processo di Produzione
Il siero fetale bovino è una miscela complessa di biomolecole che include fattori di crescita, proteine, oligoelementi, vitamine e ormoni che sono importanti per la crescita e il mantenimento delle cellule in coltura in vitro. Nello specifico, il siero fetale bovino fornisce alle cellule molti elementi, tra cui ormoni e fattori di crescita, che ne consentono la proliferazione nelle piastre di coltura. L'addizione di siero al terreno di coltura è fondamentale per l'apporto di questi fattori di crescita, ormoni, chelanti e sostanze detossificanti che inducono la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule in coltura. La moderna biologia cellulare e la biochimica hanno permesso l’identificazione dei fattori di crescita del siero coinvolti nei processi in vivo, come la proliferazione cellulare e la riparazione dei tessuti, la maturazione e differenziazione cellulare, oppure la maturazione embrionale, il lignaggio delle cellule staminali, la differenziazione epiteliale, ecc. Contiene inoltre proteine di trasporto che veicolano ormoni (ad esempio transcortina), minerali ed oligoelementi (ad esempio transferrina) e lipidi.
Il siero fetale bovino è un composto secondario dell'industria della carne, ottenuto dal sangue che viene raccolto dal feto di bovine gravide durante il processo di macellazione. La sua produzione ha origine nelle enormi mandrie di bovini "da carne" dove tori e mucche vagano liberamente insieme. Di conseguenza, molte mucche vengono trovate gravide al momento della macellazione. Si stima che circa l’8% delle vacche che giungono al macello risultino gravide in diverse fasi della gestazione. Quando, all'atto della macellazione, una mucca viene scoperta incinta, l'utero contenente il feto viene prelevato. Il sangue fetale, a questo punto, dovrebbe essere raccolto in condizioni asettiche.
La produzione del siero consiste, per prima cosa, nell'uccisione di una mucca incinta, per prelevare l'utero contenente il feto, da cui viene raccolto il sangue. Questo prelievo avviene generalmente attraverso una puntura cardiaca, inserendo l'ago attraverso le costole della gabbia toracica, un sistema che minimizza il rischio di contaminazione del siero da parte di microrganismi ambientali o provenienti dal feto stesso. In alternativa, il sangue fetale può essere raccolto mediante puntura della vena ombelicale o puntura della vena giugulare. Il siero in questione è, dunque, un "sottoprodotto" della macellazione; una volta eviscerata la vacca gravida, l'utero viene aperto e si inserisce un ago direttamente nel cuore del feto, per prelevarne il sangue, dal quale si ricava il siero fetale. È fondamentale che il feto sia sufficientemente sviluppato, e le tempistiche sono cruciali: se il cuore smette di pulsare, l'operazione diventa impossibile. Una volta raccolto, il secondo stadio della lavorazione prevede la filtrazione, in genere tramite filtro a membrana con pori di diametro 0,1µm, garantendo così la sterilità e la purezza del prodotto finale.
2. Il Ruolo Centrale del FBS nelle Applicazioni di Coltura Cellulare
Il siero fetale bovino si è dimostrato molto valido per la coltura di diverse linee cellulari, in particolare quelle eucariote, come quelle animali. È ricco di fattori di crescita e di adesione, di ormoni e altre sostanze che ne consentono la proliferazione e, allo stesso tempo, è povero di anticorpi che potrebbero danneggiare le cellule. È noto fin dagli anni '60 che il suo impiego consente il mantenimento delle linee cellulari per tempi piuttosto lunghi e, inoltre, è relativamente economico, il che ha contribuito alla sua vasta adozione nei laboratori di tutto il mondo. Le cellule sono mantenute in condizioni definite e consolidate nel tempo, che in genere coinvolgono l'incubazione a 37° C, con una miscela di gas umidificata al 5% di CO2. Un terreno di base spesso utilizzato è il Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM). A seconda del tipo di cellula, questo mezzo è completato con elementi essenziali per la proliferazione, la migrazione e la differenziazione delle cellule, e il FBS gioca un ruolo cruciale in questo completamento.
L'ampia gamma di prodotti FBS disponibili sul mercato riflette la diversità delle esigenze di laboratorio. Per i culturisti cellulari, trovare il giusto FBS è una priorità, in quanto è fondamentale selezionare il siero bovino fetale che si adatti alle specifiche esigenze di laboratorio e al budget disponibile. Esistono diverse categorie di FBS per rispondere a queste necessità. I prodotti FBS adatti per applicazioni generali di coltura cellulare sono raccolti nel portfolio FBS Classic, pensato per usi standard. Per i clienti che utilizzano l'FBS in un processo di biomanifattura, i prodotti FBS Premier sono supportati da livelli di documentazione migliorati, inclusi i Certificati di Idoneità EDQM, garantendo un'elevata qualità e tracciabilità. I prodotti designati FBS Select sono pre-qualificati per colture cellulari e tissutali specializzate, includendo la supplementazione di cellule staminali, cardiomiociti e cellule coltivate per lo sviluppo di immunoterapeutici.
L'FBS è una parte importante dell'esperimento di coltura cellulare e può contenere una miscela di fattori di crescita, ormoni, proteine, oligoelementi, vitamine e altro ancora, rendendolo un supplemento versatile e potente.
Oltre al siero bovino fetale, esistono diverse categorie di prodotti correlati per la coltura cellulare. Tra questi, i sieri certificati per origine, incluso l'FBS, che subiscono rigorosi screening e test di performance per il controllo qualità. Il siero umano è impiegato per coltivare cellule umane ed è disponibile come siero umano AB derivato dal plasma, siero umano AB da sangue intero coagulato, preparazioni inattivate al calore e preparazioni deplete di complemento. Sebbene l'FBS sia la varietà di siero più comune per la coltura cellulare, il siero bovino adulto e neonatale, e i sieri di altre specie, rappresentano alternative per la supplementazione delle colture cellulari. Vengono offerte anche diverse formulazioni ottimizzate di terreni di coltura, tra cui DMEM, RPMI-1640 e opzioni senza siero, per soddisfare le diverse esigenze cellulari. I supplementi per colture cellulari consentono la personalizzazione dei mezzi con caratteristiche definite per supportare applicazioni specifiche e le esigenze di coltura senza siero. Questi supplementi di grado colturale includono formulazioni ITS, aminoacidi, vitamine, antibiotici e reagenti qualificati per colture di ibridomi e insetti.
Le linee cellulari umane e di altre specie mammifere sono essenziali per modellare malattie e sistemi biologici e sono strumenti critici per la produzione di proteine, anticorpi, virus e vaccini. A tal fine, vengono offerte linee cellulari autenticate e prive di contaminanti, molte in collaborazione con ECACC. Infine, è disponibile una collezione di cellule primarie umane validate da PromoCell®, cellule del sangue e immunitarie primarie da BioIVT e altro ancora.
Le applicazioni di questi materiali sono variegate: vanno dalla coltura di cellule mammifere in vitro, che include tecniche asettiche, passaggi e sottocolture, e considerazioni sui mezzi di coltura, alla coltivazione di cellule primarie mammifere per screening ADME/Tox, mantenendo la rilevanza fisiologica per risultati accurati. È fondamentale anche la comprensione dei diversi tipi di cellule staminali, delle basi della loro coltura e delle loro applicazioni nella ricerca di base e clinica, come la rigenerazione tissutale, le malattie genetiche e il cancro. Si esplorano anche metodi con e senza scaffold per la coltura cellulare tridimensionale (3D), inclusi organoidi e sferoidi. La preparazione dei mezzi di coltura per la coltivazione cellulare in vitro, inclusa la preparazione di diversi formati di mezzi, i metodi di sterilizzazione, i supplementi per la crescita e la regolazione cellulare, e la conservazione e l'uso dei mezzi, sono tutti aspetti critici. Una sinossi delle condizioni, dei mezzi, dei nutrienti, della strumentazione di coltura e degli ambienti richiesti per la propagazione di successo delle cellule mammifere e di lievito completa il quadro delle molteplici applicazioni.
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3. Limiti e Criticità dell'Uso del Siero Fetale Bovino
Nonostante la sua efficacia, il siero fetale bovino presenta una serie di limiti e criticità che hanno spinto la comunità scientifica a cercare alternative. Questi problemi possono essere raggruppati in questioni etiche, scientifiche e normative/sanitarie.
3.1. Questioni Etiche e Benessere Animale
Se si pensa al coinvolgimento degli animali nella ricerca scientifica, inevitabilmente, il pensiero corre ai modelli usati per le sperimentazioni, i test di efficacia e sicurezza dei farmaci, la ricerca di base e così via. Tuttavia, non è molto noto, ma in ricerca vi possono essere degli impieghi indiretti degli animali: è ciò che avviene con il siero fetale bovino (FBS), un prodotto secondario dell’industria della carne. Il siero in questione è un “sottoprodotto” della macellazione, ma la sua raccolta solleva significative questioni etiche.
Lo sviluppo di metodi in vitro come alternativa alla sperimentazione animale ha evidenziato l'aspetto contraddittorio dell'uso di siero fetale bovino. Le questioni etiche sono incentrate sia sulla sofferenza del feto durante la raccolta del siero sia sull'uccisione di una mamma gravida e del suo figlio per ottenerlo. Sebbene il prelievo dell'FBS avvenga dopo la macellazione della mucca, in un contesto, quello dell'industria della carne, nel quale la morte del feto si verificherebbe in ogni caso, il suo prelievo - che avviene tramite una siringa inserita nel cuore - causa probabilmente dolore e stress. Sulla questione della sofferenza del feto, la mancanza della circolazione sanguigna materna dopo la morte della mamma dovrebbe provocare la morte del feto in pochi minuti in seguito a deprivazione di ossigeno. Tuttavia, le operazioni di raccolta del siero iniziano non prima dei 5 minuti dalla morte della madre (tempo necessario alle operazioni di eviscerazione) e possono durare fino ai 40 minuti dopo la morte della stessa. Questo intervallo temporale rende plausibile che il feto possa esperire dolore.
Il principio che guida la ricerca è quello delle 3R (replacement, reduction, refinement), che ha lo scopo complessivo di ridurre quanto più possibile il coinvolgimento degli animali. Se l'attenzione, pubblica ma anche da parte degli stessi ricercatori, si accende soprattutto sulla sperimentazione - ossia, in generale, sulle pratiche e gli esperimenti che coinvolgono in modo diretto gli animali - la discussione sul siero fetale bovino evidenzia come in realtà l’interesse per la tutela degli animali abbia uno spettro anche più ampio, come commenta Giuliano Grignaschi, portavoce di Research4Life. Questo spinge molti scienziati a indagare la possibilità di usare altri tipi di additivi per i terreni di coltura cellulare.
3.2. Sfide Scientifiche: Variabilità e Riproducibilità
Oltre alle implicazioni etiche, l'uso dell'FBS presenta significativi limiti scientifici. Sebbene il siero fetale bovino sia da una parte un supplemento che si è dimostrato molto valido per la coltura di diverse linee cellulari, la sua composizione esatta non è del tutto nota. Come per la stragrande maggioranza dei prodotti di origine animale, ogni partita di siero può presentare delle differenze rispetto ad altre provenienti da diverse regioni o prelevate in momenti diversi dell’anno. Ciò determina una certa variabilità del siero in grado d’influenzare direttamente il risultato sperimentale.
I lotti di siero mostrano variazioni quantitative e qualitative nella loro composizione e quindi introducono una significativa variabilità, rendendo gli esperimenti (e quindi i risultati) difficilmente, o per nulla, riproducibili. Le cellule coltivate con un certo lotto di FBS possono presentare differenze morfologiche, o crescere in modo diverso, o ancora rispondere in modo differente nel setting sperimentale da un laboratorio all’altro. In altre parole, l’uso del FBS può compromettere la riproducibilità di un esperimento. La non riproducibilità di molti risultati ottenuti con colture cellulari, oltre che con modelli animali, viene riconosciuta come fonte di grave preoccupazione all’interno della comunità scientifica e non solo, anche in funzione del depauperamento delle ingenti risorse investite ogni anno nella ricerca biomedica. Inoltre, i terreni di coltura siero-integrati possono essere incapaci di sostenere la crescita di specifici tipi di cellule, e nelle colture primarie di cellule epiteliali altamente differenziate il siero animale può essere incapace di prevenire la crescita eccessiva della coltura da fibroblasti.
3.3. Rischi di Contaminazione e Normative Sanitarie
Un altro aspetto critico riguarda la sicurezza. La provenienza del siero fetale bovino fa sì che si possano presentare dei problemi di contaminazione dovuti alla presenza di tossine o patogeni. Questo è stato particolarmente evidente all’inizio degli anni ’90, a seguito dei casi di encefalopatia spongiforme bovina (la cosiddetta “mucca pazza”), una patologia dovuta alla presenza di un prione, cioè una proteina alterata, che causa gravissimi danni all’apparato nervoso.
Il siero bovino fetale (FBS) ha vantato un eccellente record di sicurezza prima di allora. Tuttavia, la comparsa dell'encefalopatia spongiforme bovina (BSE) nel 1986 e la sua successiva diffusione nell'Europa continentale, insieme alla scoperta del suo probabile legame con una nuova variante della malattia di Creutzfeldt Jacob nell'uomo, hanno aumentato le preoccupazioni sulla sicurezza dell'approvvigionamento di tutti i materiali bovini. L'identificazione della BSE ha provocato una scossa nella comunità scientifica. Questa malattia neurodegenerativa dei bovini non solo rappresentava una minaccia per la salute degli animali, ma sollevava anche allarmanti interrogativi sulla sicurezza dei materiali di derivazione bovina nelle applicazioni umane.
In risposta alle crescenti preoccupazioni legate alla BSE, nel 1993 la Food and Drug Administration (FDA) ha assunto una posizione proattiva. L'agenzia ha emesso una raccomandazione cruciale che avrebbe avuto un impatto significativo sull'approvvigionamento di materiali bovini per la ricerca biomedica e la produzione farmaceutica. In particolare, la FDA "raccomandava di non utilizzare materiali derivati da bovini che hanno risieduto o provengono da Paesi in cui è stata diagnosticata la BSE". Questa linea guida ha rappresentato un momento cruciale nella regolamentazione del siero fetale bovino (FBS) e di altri prodotti di derivazione bovina, creando una restrizione geografica sull'approvvigionamento di questi materiali, con l'obiettivo di ridurre al minimo il rischio di trasmissione della BSE attraverso i prodotti biofarmaceutici.
L'Unione Europea (UE) ha adottato un approccio globale per garantire la sicurezza del siero bovino fetale (FBS) nelle applicazioni biofarmaceutiche. Le linee guida dell'UE sulla sicurezza virale hanno stabilito un quadro sfaccettato che va oltre le semplici restrizioni geografiche. Queste linee guida si concentrano su tre aspetti critici: l'approvvigionamento, i test e la minimizzazione dei rischi di contaminazione incrociata. La componente di approvvigionamento prevede una documentazione rigorosa dell'origine dei materiali bovini, per garantire che provengano da regioni esenti da BSE. I requisiti di analisi sono rigorosi e richiedono uno screening completo di vari agenti patogeni per garantire la purezza e la sicurezza della FBS. In particolare, le linee guida dell'UE pongono particolare enfasi sui potenziali rischi di contaminazione incrociata durante il processo di macellazione o di raccolta del tessuto di partenza.
L'uso di siero bovino fetale (FBS) nei processi di produzione dei medicinali è accettabile, a condizione che venga presentata una documentazione completa. Questa documentazione costituisce una componente critica del processo di garanzia della sicurezza e comprende in genere tre elementi chiave. In primo luogo, sono richieste informazioni dettagliate sulla provenienza del FBS, che garantiscano la tracciabilità in regioni esenti da BSE. In secondo luogo, devono essere forniti dati sull'età degli animali da cui è stato ricavato il siero, poiché gli animali più giovani sono generalmente considerati a rischio minore. Infine, devono essere inclusi i risultati di test approfonditi sull'assenza di agenti avventizi, che dimostrino l'assenza di potenziali contaminanti nel siero. I fornitori responsabili di FBS per applicazioni biofarmaceutiche sono tenuti a fornire questa documentazione completa come prassi standard. Questo rigoroso processo di documentazione non solo soddisfa i requisiti normativi, ma svolge anche un ruolo cruciale nel mantenere la sicurezza e l'integrità dei prodotti biofarmaceutici che utilizzano FBS nella loro produzione. A ciò, vale la pena aggiungere quanto riportato dal report "Fetal Bovine Serum (FBS): Past-Present-Future" pubblicato dall’Unione Europea a seguito del terzo workshop sul tema, nel 2018: la mancanza d’informazioni precise su produzione, domanda e volumi di siero fetale bovino a livello globale rendono possibili frodi e abusi.
Il panorama dell'uso di FBS nei biofarmaci si è evoluto in modo significativo dopo la comparsa della BSE nel 1986. Organismi di regolamentazione come la FDA e l'UE hanno implementato linee guida rigorose per garantire l'approvvigionamento e l'uso sicuro di FBS. Sebbene la documentazione e i test adeguati rimangano fondamentali per le attuali applicazioni di FBS, l'industria si sta gradualmente spostando verso alternative prive di animali.
4. La Ricerca di Alternative al FBS: Verso Terreni di Coltura Siero-Liberi
È per tutte queste ragioni - etiche, scientifiche e normative - che molti scienziati chiedono e indagano la possibilità di usare altri tipi di additivi per i terreni di coltura cellulare. Diversi sono quelli disponibili, di origine animale o vegetale o anche completamente di sintesi. Il documento europeo si chiude con una serie di raccomandazioni che vanno proprio nella direzione di aumentare gli sforzi alla ricerca di tali alternative e limitare, dove possibile, l’uso del siero fetale bovino.
Alternative all'FBS si riferiscono a supplementi o formulazioni di mezzi sviluppati per sostituire l'FBS nei sistemi di coltura cellulare. I mezzi con contenuto ridotto di siero combinano FBS minimo con supplementi definiti, bilanciando costi ed etica. Questo approccio è un passo intermedio verso la completa eliminazione del siero di origine animale.
4.1. Alternative di Origine Umana e Sintetica
Per quanto riguarda le ricerche su applicazioni cliniche, in particolare, si preferiscono di norma terreni di coltura privi di sostanze derivate da altre specie animali e contenenti invece, per esempio, siero umano o lisati di piastrine umane (human platelet lysates). Questi ultimi, secondo alcuni articoli (tra cui una recente review pubblicata sul Journal of Translational Medicine), si dimostrano valide alternative all’uso del FBS.
Per questa ragione, soprattutto laddove la riproducibilità risulta particolarmente importante, sempre maggior attenzione è rivolta agli additivi sintetici, di composizione ben definita e specifici per ogni tipo cellulare. Tuttavia, nemmeno le sostanze di sintesi sono completamente prive di limiti. Tra questi, van der Valk segnala per esempio una formulazione per cui non è sempre data la possibilità di conoscere le quantità esatte dei diversi componenti, e quindi i loro potenziali effetti sulle cellule, per ragioni commerciali e di proprietà del produttore. Insomma, come conclude anche il report europeo, non è possibile cessare l’impiego di FBS senza avere alternative altrettanto valide - pur considerandone i problemi scientifici, cui si aggiungono alcune considerazioni etiche.
4.2. Nuove Alternative Cruelty-Free e Sostenibili
Il corpo dell’elaborato si concentra anche sull'analisi di due potenziali alternative a questo supplemento, ovvero estratti di fermentati di okara e ClearX9TM, insieme a una delle prime alternative cruelty-free introdotte: gli idrolizzati proteici. Il metodo di produzione e le caratteristiche composizionali dell'okara sono inclusi, offrendo una panoramica su questa risorsa vegetale. Viene fornita, poi, una breve descrizione sull’azienda indiana “ClearMeat” e sulla gamma di prodotti che offrono, evidenziando il loro contributo allo sviluppo di alternative sostenibili. L’analisi di questi due nuovi supplementi si concentra maggiormente sui dati relativi alla loro efficienza di crescita cellulare. In particolar modo, sono riportate le percentuali di sopravvivenza nel tempo delle linee cellulari utilizzate nei vari studi in confronto alle performance ottenute con l’FBS. Vengono di seguito presi in considerazione i loro vantaggi economici, etici, ambientali, di sicurezza e di reperibilità.
Un esempio di successo in questa direzione è il "Vero serum free", un risultato abbastanza valido e messo in commercio con varie formulazioni. Viene usato soprattutto su una linea di cellule derivata da un cercopiteco (Vero cells), ed attualmente soprattutto in virologia. I terreni serum free si usano anche quando è richiesta estrema riproducibilità e nessuna differenza tra lotto e lotto, ma ancora non sono perfezionati e spesso danno ancora problemi, indicando la necessità di ulteriori ricerche e ottimizzazioni. Nonostante l'uso di lunga data del siero bovino fetale (FBS) nella produzione di molti medicinali, compresi i vaccini virali e i prodotti a DNA ricombinante, nell'industria biofarmaceutica si registra una tendenza crescente ad abbandonare i materiali di origine animale. Questo spostamento è determinato dai requisiti normativi in Europa che sottolineano l'importanza di giustificare l'uso di materiali derivati da fonti bovine, caprine o ovine nella produzione farmaceutica. In risposta a questa tendenza, aziende come SigmaAldrich lavorano a stretto contatto con i clienti per sviluppare e ottimizzare formulazioni di terreni di coltura privi di origine animale che soddisfino requisiti specifici per le colture cellulari. Questa transizione rappresenta un'evoluzione significativa nella produzione biofarmaceutica, con l'obiettivo di ridurre i rischi potenziali associati ai materiali di origine animale, mantenendo o migliorando l'efficacia e la sicurezza dei prodotti. Il movimento verso processi privi di animali si allinea anche con gli obiettivi più ampi del settore, che prevedono una maggiore sostenibilità e considerazioni etiche nella produzione farmaceutica.
5. Il Contesto dei Metodi In Vitro e il Principio delle 3R
Nella ricerca biomedica e tossicologica, i metodi in vitro, cioè quegli approcci di prova sperimentale che si avvalgono dell’utilizzo di materiale biologico come cellule e tessuti, si possono utilizzare per studiare le attività metaboliche delle cellule. In particolare, all’interno della ricerca biomedica e tossicologica, nell’ottica del principio delle 3R (Refinement, Reduction, Replacement), essi potrebbero dimostrarsi validi strumenti per riuscire a ridurre od anche sostituire gli esperimenti condotti su animali, sia come ”stand-alone”, sia come parte di una ”strategia integrata di valutazione e sperimentazione” insieme ad altri metodi non basati sull’animale come quelli in silico. L'implementazione di colture in vitro al posto di animali mira a ridurre il numero di cavie utilizzate in ricerca biomedica, affrontando così le preoccupazioni etiche e scientifiche.
I famosi metodi in vitro sono spesso la seconda fase che si attraversa per testare farmaci e sostanze varie. Tuttavia, "in vitro" è un termine che vuol dire tutto e nulla: molti test in vitro utilizzano tessuti prelevati da animali o parti di animali uccisi a scopo alimentare. Ad esempio, i test di irritazione e corrosione oculare acuta (per sostanze che in modo diretto o indiretto possono venire a contatto con gli occhi) sono stati completamente sostituiti da metodi in vitro. Tra questi, il Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) utilizza la cornea di bovino (derivata dalla macellazione), l'Isolated Chicken Eye (ICE) usa l'occhio di pollo isolato in vitro, e il Cytosensor Microphysiometer Method impiega fibroblasti di topo in vitro. Sono tutti validati, ufficiali e vengono usati per testare le sostanze altamente irritanti, ed eliminare quelle che risultano dannose per gli occhi.
Esistono poi modelli avanzati come Epiderm e Skinethic, pure metodi alternativi all’uso di animali, registrati e validati. Si tratta di colture tridimensionali di pelle umana, complete di strato corneo, usate, insieme a Episkin (un modello di epitelio umano), per testare sostanze potenzialmente irritanti o corrosive (ad esempio detersivi, che devono essere testati anch'essi).
È importante sottolineare che, in ogni caso, un test in vitro non permette di valutare tutte le conseguenze sistemiche. Ad esempio, nel caso di una chemioterapia, non si potrebbero valutare in alcun modo le conseguenze sul sistema immunitario (ed eventuali infezioni opportunistiche anche letali), sul sistema cardiocircolatorio, sul sistema nervoso, sui reni e così via. Questo evidenzia la complessità della ricerca e la necessità di un approccio integrato che, pur privilegiando metodi alternativi, consideri anche i limiti intrinseci di ciascun approccio. La ricerca di alternative al siero fetale bovino si inserisce pienamente in questo contesto, puntando a migliorare sia l'affidabilità scientifica sia l'etica della ricerca.