I Misteri dello Sviluppo Embrionale
Lo sviluppo embrionale, o embriogenesi, è il processo mediante il quale l'embrione si forma e si sviluppa, un viaggio affascinante che trasforma una singola cellula in un organismo complesso e funzionante. Come faccia una cellula uovo fecondata a trasformarsi in un embrione che cresce e si diversifica è, ancora oggi, uno dei misteri più affascinanti della biologia. Questo processo coinvolge molteplici e complessi processi morfogenetici che modellano l’embrione attraverso l'auto-organizzazione delle cellule staminali pluripotenti e dei tessuti che ne derivano.
A differenza di pesci, anfibi e uccelli, il cui sviluppo è più facilmente osservabile, quello dei mammiferi sfugge ai nostri occhi dal momento che l’embrione si impianta in utero. La struttura subisce grandi cambiamenti e sviluppa i precursori dei vari organi, un processo altamente complesso che lascia ancora molti interrogativi aperti. Il topo rappresenta un modello di studio fondamentale nella biologia dello sviluppo dei mammiferi e nella ricerca sui difetti alla nascita, grazie alla sua somiglianza genetica e fisiologica con l'uomo e alla facilità di manipolazione genetica e osservazione. La coltura di interi embrioni di topo è un metodo importante impiegato in questo campo.
Le Prime Fasi della Vita: Fecondazione e Segmentazione
Lo sviluppo embrionale comincia con la fecondazione della cellula uovo aploide, da parte di uno spermatozoo anch'esso aploide. Questo evento cruciale segna l'inizio della vita di un nuovo individuo, portando alla formazione di una cellula diploide dotata di tutte le informazioni genetiche necessarie a sviluppare un intero organismo funzionante.
Dei circa 300 milioni di spermatozoi umani eiaculati durante il coito, solo 200 circa raggiungono l'ovidotto, un numero esiguo che evidenzia la selezione naturale già in atto. Da qui, gli spermatozoi devono superare alcuni strati di cellule granulose, attaccarsi e attraversare la zona pellucida e fondere la propria membrana cellulare con quella della cellula uovo. La presenza dell'enzima ialuronidasi legato alla membrana cellulare anteriore dello spermatozoo, lo aiuta ad attraversare la matrice extracellulare che circonda le cellule granulose. L'azione dell'enzima digerisce l'acido ialuronico che compone la matrice extracellulare e gli permette di aggirare queste cellule e proseguire il suo cammino verso l'obiettivo finale.
Nei pressi della cellula uovo, lo spermatozoo si attacca alla zona pellucida attraverso un complesso meccanismo che coinvolge numerose proteine di membrana. L'attivazione di queste proteine induce una cascata di eventi intracellulari nello spermatozoo, che si concludono con l'esocitosi della vescicola acrosomica. Il contenuto enzimatico della vescicola si riversa dunque verso la zona pellucida e inizia a digerirla, in modo da far passare lo spermatozoo verso la cellula uovo e favorirne la fusione cellulare. I meccanismi molecolari responsabili del processo di fusione delle due membrane plasmatiche non sono del tutto chiari, sebbene si sia scoperta l'esistenza di due proteine necessarie al processo: Izumo1 e CD9.
La fusione delle membrane attiva la cellula uovo, facendo aumentare la concentrazione di calcio nel citosol. Quest'aumento di cationi è responsabile della depolarizzazione della membrana plasmatica, che allontana gli altri spermatozoi. Tutto ciò serve a prevenire eventi di polispermia, ovvero più fecondazioni da parte di diversi spermatozoi, un fenomeno che sarebbe letale per lo sviluppo dell'embrione. La fecondazione si conclude con la fusione del materiale genetico dello spermatozoo con quello della cellula uovo.
La nuova cellula che si origina prende il nome di zigote ed è una cellula diploide che possiede tutte le informazioni genetiche necessarie a sviluppare un intero organismo funzionante. La morfologia dello zigote dipenderà principalmente dalla forma della cellula uovo, in quanto lo spermatozoo apporta a quest'ultima solo il materiale genetico contenuto nel suo nucleo e i centrioli.
Il processo che porta lo zigote alla pluricellularità è chiamato segmentazione. Conseguenti divisioni mitotiche senza accrescimento, ovvero senza le fasi G1 e G2, portano lo zigote a dividersi (segmentarsi) in 2 cellule figlie chiamate blastomeri, poi in 4, in 8, in 16 e così via. Queste divisioni avvengono rapidamente, aumentando il numero di cellule ma senza un significativo aumento delle dimensioni complessive dell'embrione. Dopo che la settima divisione ha prodotto 128 cellule, l'embrione prende il nome di Blastula.
Dalla Blastocisti alla Gastrulazione: La Formazione dei Foglietti Embrionali
Nei mammiferi, la blastula in questa fase forma una struttura specializzata chiamata blastocisti. Questa è caratterizzata da una massa cellulare interna, da cui proseguirà lo sviluppo dell'embrione, che è distinta dalla blastula circostante. Nel topo, le cellule germinali primordiali derivano da uno strato di cellule nella massa cellulare interna della blastocisti, specificamente dall'epiblasto, come risultato di un'ampia riprogrammazione dell'intero genoma. Le cellule staminali embrionali (ESC) pluripotenti, presenti nella massa cellulare interna, sono fondamentali, poiché possono dare origine a quasi tutti i tipi di cellule dell'organismo. Le cellule staminali trofoblastiche extra-embrionali (TSC), invece, formeranno la placenta, una struttura vitale per il nutrimento e lo scambio di sostanze. Infine, le cellule staminali endodermiche formeranno il sacco vitellino, che, insieme ad altri annessi embrionali, è deputato a fornire tutto ciò di cui l'embrione necessita per il suo corretto sviluppo.
Il processo che porta la blastula ad essere un embrione triblastico, ossia dotato di 3 foglietti embrionali - ectoderma, mesoderma ed endoderma - è detto gastrulazione. Questa fase è cruciale per l'organizzazione spaziale dell'embrione e la determinazione delle future strutture corporee. Durante la gastrulazione, la blastula si trasforma, e un'area della superficie più esterna (ectoderma) si alza fino a formare un ponte, la cresta neurale, che chiudendosi va a formare il tubo neurale. Questo è il primo abbozzo che poi si svilupperà nella colonna vertebrale e nel midollo spinale che corre al suo interno, segnando l'inizio dello sviluppo del sistema nervoso centrale. Parallelamente, la blastula invagina una porzione di ectoderma (che diventerà poi la bocca) fino a collegarla ad un'altra porzione invaginata (l'ano) e formando di fatto un tubo continuo che si svilupperà poi durante l'organogenesi nel tubo digerente. L'intero tubo digerente è ricoperto dall'endoderma, il foglietto embrionale più interno.
La Somitogenesi e l'Organogenesi Iniziale: Abbozzi di un Organismo
Dopo la gastrulazione, l'embrione continua il suo percorso di specializzazione cellulare e formazione di strutture più complesse. La somitogenesi è il processo mediante il quale vengono prodotti i somiti, che sono segmenti primitivi. Questo processo inizia con la formazione di somitomeri che segnano i futuri somiti nel mesoderma. Il mesoderma presomitico dà origine a coppie successive di somiti, di aspetto identico che si differenziano negli stessi tipi di cellule. Tuttavia, le strutture formate dalle cellule variano a seconda della parte antero-posteriore dell'embrione; ad esempio, le vertebre toraciche avranno costole, mentre le vertebre lombari no.
Verso la fine della seconda settimana dopo la fecondazione inizia la segmentazione trasversale del mesoderma parassiale, che viene convertito in una serie di masse ben definite, più o meno cubiche, note anche come somiti. Questi somiti occupano l'intera lunghezza del tronco su entrambi i lati della linea mediana, estendendosi dalla regione occipitale della testa. Ogni segmento contiene una cavità centrale che, tuttavia, viene presto riempita di cellule angolari a forma di fuso. I somiti giacciono immediatamente sotto l'ectoderma sull'aspetto laterale del tubo neurale e della notocorda e sono collegati al mesoderma laterale dalla massa cellulare intermedia. Quelli del tronco possono essere disposti nei seguenti gruppi, a seconda della loro posizione e funzione: cervicale 8, toracico 12, lombare 5, sacrale 5 e coccigeo da 5 a 8. Quelli della regione occipitale della testa sono generalmente descritti come quattro.
Ad un certo punto, dopo che i diversi strati germinali sono stati definiti e i somiti hanno iniziato a formarsi, inizia l'organogenesi. Il primo stadio nei vertebrati è chiamato neurulazione, dove la placca neurale si piega formando il tubo neurale, precursore del cervello e del midollo spinale. Nella maggior parte degli animali l'organogenesi, insieme alla morfogenesi, si traduce in una larva, ma nei mammiferi porta direttamente alla formazione del feto. Mouse whole embryo culture è un metodo importante impiegato nella biologia dello sviluppo dei mammiferi e nella ricerca sui difetti alla nascita, permettendo di osservare questi processi fondamentali. Per la coltura di embrioni di topo, EmbryoMax® Advanced KSOM Medium è un medium all-in-one per la raccolta e la coltura degli embrioni di topo, sostituendo il tradizionale sistema a due fasi dove formulazioni uniche e separate sono richieste per la raccolta e la coltura degli embrioni.
Il giorno dopo il prelievo ovocitario: la fertilizzazione
Rivoluzione in Laboratorio: Embrioni di Topo da Cellule Staminali
Il mistero di come una cellula uovo fecondata si trasformi in un embrione che cresce e si diversifica ha spinto la ricerca verso la creazione di modelli in vitro che riproducano le prime fasi della gestazione. Finora, i tentativi di ottenere strutture embrionali in vitro usando solo staminali embrionali hanno avuto un successo limitato: anche le prime fasi di sviluppo degli embrioni richiedono infatti tipi di cellule differenti che si coordinano le une con le altre.
Un gruppo di scienziati dell'Università di Cambridge, nel Regno Unito, guidato da Magdalena Zernicka-Goetz, ha intrapreso una strada diversa, riuscendo in parte a replicare questo processo in laboratorio, generando un embrione di topo a partire non da cellule sessuali ma da due tipi di staminali, che si sono riorganizzate e coordinate ripercorrendo le prime fasi della gestazione, così come sarebbe avvenuto nell'utero. Questo approccio ha permesso di realizzare un embrione di topo in coltura che riproduce fedelmente molti meccanismi di sviluppo di un embrione di topo naturale, anche se non può dare origine a un feto.
I ricercatori hanno usato una combinazione di staminali embrionali (ESC) e trofoblastiche extraembrionali (TSC) di topi geneticamente modificati, fatte crescere su un'impalcatura tridimensionale nota come matrice extracellulare. Queste sono le cellule staminali embrionali pluripotenti, da cui proseguirà lo sviluppo dell'embrione, e le cellule staminali trofoblastiche extra-embrionali, che formeranno la placenta. Nel 2017, lo stesso gruppo di ricerca aveva ottenuto il primo embrione sintetico a partire da cellule staminali embrionali, ma non era in grado di percorrere tutte le fasi dello sviluppo. La grande differenza in un nuovo esperimento è stata nel fatto che i ricercatori sono riusciti a far dialogare le cellule fra loro, in modo che si assemblassero in modo spontaneo, senza la necessità di stimoli esterni, utilizzando una combinazione di cellule staminali embrionali, cellule della struttura necessaria al nutrimento dell'embrione (trofoblasto) e cellule extra-embrionali (ETiX), tutte di topo.
"Le cellule embrionali e quelle extra-embrionali iniziano a comunicare le une con le altre e a organizzarsi in una struttura che somiglia a un embrione e si comporta come un embrione”, ha spiegato Zernicka-Goetz. “In sintesi: ha regioni anatomicamente corrette che si sviluppano nel posto giusto al momento giusto”. È stato per la prima volta ottenuto un embrione di topo sintetico che ha raggiunto lo sviluppo record di 8,5 giorni, con cervello e cuore battente. L'embrione si è sviluppato per otto giorni e mezzo, dando origine a una struttura complessa e differenziata che comprende alcune regioni del cervello, il tubo neurale che dà origine al sistema nervoso, una struttura simile a un cuore in grado di battere e un'altra simile all'intestino. In questo vero e proprio laboratorio vivente in miniatura, i ricercatori hanno anche dimostrato di poter riprodurre le caratteristiche osservate nei cosiddetti topi di laboratorio knockout, ossia privati di un gene allo scopo di studiare caratteristiche fisiologiche o le cause di malattie.
Questi risultati sono il culmine di oltre un decennio di ricerca e potrebbero aiutare i ricercatori a capire perché alcuni embrioni falliscono mentre altri si trasformano in un feto come parte di una gravidanza sana. “Sappiamo che le interazioni tra i diversi tipi di cellule staminali sono importanti per lo sviluppo, ma la cosa sorprendente è che il nostro lavoro mostra ora che si tratta di una vera collaborazione, senza cui lo sviluppo anatomico e la corretta successione dei meccanismi biologici cruciali non possono avvenire in modo corretto”. L'embrione artificiale dunque somiglia molto a quello naturale, e comprende anche staminali che si possono specializzare nel tessuto della placenta, ma è improbabile che si possa sviluppare in un feto sano, perché mancano le cellule da cui ha origine il sacco vitellino. Tuttavia, gli autori già pensano a come perfezionare ulteriormente la loro tecnica per arrivare a risultati ancora più avanzati.
Modelli Avanzati di Coltura 3D: Le "Trunk-Like-Structures"
L'osservazione diretta dello sviluppo dei mammiferi dopo l'impianto nell'utero è estremamente difficile. Sebbene sia considerato abbastanza semplice isolare un embrione quando non è ancora impiantato, una volta superata la fase d’impianto nell’endometrio diventa estremamente isolato e difficile da osservare. Questo impedimento ha stimolato lo sviluppo di vari sistemi di cellule staminali tridimensionali per studiare i complessi processi morfogenetici.
I ricercatori del MPIMG sono riusciti a replicare una fase centrale dello sviluppo embrionale di topo in una capsula Petri, la banale piastra di laboratorio in cui si fanno crescere le colture cellulari di vario tipo. Hanno fatto crescere la parte centrale del tronco dell’organismo partendo da cellule staminali embrionali. Le cosiddette “Trunk-Like-Structure” (strutture simili al tronco) hanno sviluppato in soli cinque giorni i precursori per i tessuti neurali, ossei, cartilaginei e muscolari a partire da aggregati disordinati di cellule. Queste strutture sono grandi circa un millimetro e possiedono un tubo neurale da cui si svilupperebbe il midollo spinale. Inoltre, hanno somiti, che sono i precursori di scheletro, cartilagine e muscolo. Alcune delle strutture sviluppano anche i precursori di organi interni come l'intestino.
Il punto cruciale di questo nuovo metodo di coltura cellulare sperimentale risiede nell'uso di cellule staminali fatte crescere in una struttura gelatinosa che imita le proprietà della matrice extracellulare e fornisce supporto e orientamento spaziale. A differenza dei più recenti sistemi di cellule staminali tridimensionali che riescono a produrre i cosiddetti gastruloidi, in questo caso si formano delle strutture con l’aspetto tipico di un embrione. Dov’è la differenza? Nei segnali generati dall’innovativa sostanza gel utilizzata, il Matrigel, che è un surrogato della matrice extracellulare. Durante lo sviluppo embrionale, la matrice extracellulare fornisce stimoli chimici e meccanici essenziali. In vitro, il Matrigel può guidare la morfogenesi e questo ha portato i ricercatori ad utilizzarlo in varie condizioni per valutarne l'efficacia e a stabilire che il 5% di Matrigel è sufficiente per indurre la formazione di strutture organizzate.
“Il gel fornisce supporto alle cellule coltivate e le orienta nello spazio; ad esempio, possono distinguere l'interno dall'esterno”, ha spiegato il primo autore dello studio Jesse V. Veenvielt. Dopo quattro o cinque giorni, il gruppo di ricerca ha separato le strutture, isolando le cellule e analizzandole singolarmente. "Anche se non tutti i tipi di cellule embrionali sono presenti nelle Trunk-Like-Structure, sono sorprendentemente simili ad un embrione della stessa età", dice Adriano Bolondi, co-autore dello studio. Insieme alla bioinformatica Helene Kretzmer, gli autori hanno confrontato l'attività genetica delle strutture in vitro con gli embrioni di topo.
Grazie a questa tecnica innovativa di coltura è possibile esaminare ogni fase iniziale dello sviluppo direttamente, in modo continuo e su un numero di campioni a scelta e in crescita contemporanea. Questo cambia radicalmente il modello di studio standard e permette di analizzare processi complessi come la morfogenesi, aprendo nuove vie per la comprensione profonda dello sviluppo embrionale dei mammiferi.
Il Topo Oltre i Confini Terrestri: Embrioni nello Spazio
In una dimostrazione senza precedenti di capacità scientifica e logistica, per la prima volta nella storia, embrioni di topo ai primissimi stadi di sviluppo sono stati congelati e spediti sulla Stazione Spaziale Internazionale (International Space Station, Iss). Questo esperimento ha aperto nuove frontiere per comprendere l'impatto della microgravità e delle radiazioni sullo sviluppo embrionale, offrendo una prospettiva unica sulle potenziali sfide della riproduzione umana nello spazio profondo.
La ricerca è stata condotta da un gruppo di ricercatori dell’Università di Yamanashi (Giappone), che ha estratto embrioni alle primissime fasi di sviluppo da femmine di topo in gravidanza. Ciascun embrione, costituito da due sole cellule, è stato poi congelato e spedito nell’agosto del 2021 sulla Stazione Spaziale Internazionale (Iss). Per permettere agli astronauti della Iss di scongelarli e mantenerli in coltura nelle condizioni più appropriate, il gruppo di ricerca ha inoltre sviluppato delle apposite embryo thawing and culturing unit (Etc, unità di scongelamento e coltura degli embrioni), che sono servite anche per spedire gli embrioni sulla Iss e garantire la loro vitalità durante il trasporto e la permanenza.
Una volta arrivati a destinazione e scongelati, metà degli embrioni è stata fatta crescere per quattro giorni in condizioni di cosiddetta microgravità, quella che caratterizza l’ambiente della Iss. L’altra metà è invece cresciuta, sempre per quattro giorni e all’interno della Iss, in un ambiente che simula la gravità terrestre, costituendo così un controllo cruciale per l'esperimento. Infine, un’altra porzione di embrioni è rimasta sulla Terra: anche questi sono stati fatti crescere per quattro giorni dopo essere stati congelati e scongelati in modo simile a quanto fatto per gli embrioni spediti nello spazio, fornendo un ulteriore termine di paragone.
Dopo i quattro giorni in coltura, le cellule embrionali coltivate sulla Iss sono state trattate con apposite sostanze chimiche che le “congelano” (questa volta in senso metaforico) e ne consentono il mantenimento a lungo termine, anche se in uno stato non più vitale. Questo ha permesso di rispedirle sulla Terra per essere poi analizzate e paragonate al “controllo terrestre”, permettendo una valutazione dettagliata del loro sviluppo.
In termini percentuali, il tasso di sopravvivenza degli embrioni coltivati a bordo della Iss è stato pari a circa la metà rispetto a quello osservato per gli embrioni cresciuti a Terra. Tuttavia, le cellule degli embrioni che sono sopravvissuti e che sono cresciuti nella condizione di microgravità sono state in grado di svilupparsi e differenziarsi in modo normale e analogo alle cellule degli embrioni facenti parte dei due controlli, sia quello in gravità simulata sulla ISS sia quello a terra. Anche il Dna delle cellule coltivate a bordo della Iss (sia in condizioni di microgravità che di gravità terrestre “artificiale”) non sembra aver subito danni evidenti dovuti all’esposizione a radiazioni più potenti rispetto a quelle che raggiungono la superficie terrestre, un risultato rassicurante per future missioni spaziali.
Naturalmente, sottolineano gli stessi autori della ricerca, saranno necessari ulteriori studi per validare i risultati di questo primo esperimento, che rappresenta un importante passo preliminare. Inoltre, si tratta di osservazioni molto importanti, che però riguardano solo una brevissima parte del completo sviluppo embrionale e, soprattutto, dell’intera gravidanza. Per il futuro, il gruppo di ricerca pianifica ad esempio di studiare un modo per ricongelare gli embrioni dopo la fase di coltura sulla Iss, in modo da poterli scongelare di nuovo una volta riportati sulla Terra e provare a impiantarli nell’utero di femmine di topo, testando così la loro capacità di completare l'intero sviluppo.
Prospettive Future: Dalla Ricerca Biomedica ai Trapianti
Gli sviluppi nella ricerca sullo sviluppo embrionale del topo, sia attraverso la creazione di embrioni sintetici che l'esplorazione di condizioni ambientali estreme, aprono scenari promettenti per la scienza biomedica. I risultati ottenuti con gli embrioni sintetici, capaci di autoassemblarsi e di sviluppare strutture complesse come il cervello e il cuore battente, potrebbero aiutare i ricercatori a capire perché alcuni embrioni falliscono mentre altri si trasformano in un feto come parte di una gravidanza sana. Si pensa che due terzi delle gravidanze umane fallisca in questa fase, prima ancora che una donna possa rendersi conto di essere incinta. L'esperimento dell'università di Cambridge non ha come scopo la creazione di un embrione, sia di topo che umano, capace di crescere fuori dall'utero, e non sarebbe comunque possibile con la tecnologia attuale. È servito invece a indagare le prime fasi dello sviluppo embrionale, quelle che precedono l'impianto.
Inoltre, i risultati potrebbero essere utilizzati per guidare lo sviluppo di organi umani sintetici per il trapianto. Lo stesso gruppo di ricerca sta lavorando a un modello di embrione umano analogo a quello di topo appena ottenuto e l'obiettivo è riuscire a comprendere passaggi cruciali dello sviluppo embrionale altrimenti impossibili da osservare in embrioni umani reali. Se in futuro la tecnica sperimentata nei topi avrà successo anche con cellule staminali umane, dicono i ricercatori, si potranno costruire in laboratorio organi per i trapianti destinati ai pazienti in lista d'attesa. "Nel mondo ci sono tante persone che attendono anni per avere un trapianto", osserva Zernicka-Goetz. "Quello rende il nostro lavoro così entusiasmante è che le conoscenze che ne derivano potranno essere utilizzate per coltivare in futuro organi umani sintetici per salvare vite". Coltivare organi, conclude, "aiuterebbe anche a capire meglio come sono fatti e a curarli in modo più efficace".
“Riteniamo che presto sarà possibile riprodurre molti degli eventi che si verificano prima del quattordicesimo giorno usando staminali embrionali ed extraembrionali umane in un approccio simile a quello che ha avuto successo con i topi”, ha spiegato Zernicka-Goetz.
Queste direzioni future sottolineano l'importanza della ricerca biomedica e la necessità di sostegno per essa. Di recente, Research4Life e la comunità scientifica, rappresentata da 45 firmatari, hanno pubblicato una lettera aperta alle massime cariche della Repubblica italiana per chiedere ed ottenere risposte a favore della ricerca biomedica, osteggiata e minacciata dagli animalisti che bloccano progetti di ricerca e oggi, di fatto, i lavori parlamentari. La comprensione approfondita dello sviluppo embrionale, resa possibile da questi studi innovativi, è fondamentale non solo per avanzare nella conoscenza di base della biologia, ma anche per trovare soluzioni concrete a problemi medici urgenti, come le cause delle malformazioni congenite o la carenza di organi per i trapianti.